重楼皂苷Ⅰ对人乳腺癌细胞MCF-7体内外生长的抑制作用
2015-01-16胡炜彦贺智勇张荣平
胡炜彦, 李 菊, 贺智勇, 付 昆, 张荣平*
(1.昆明医科大学药学院云南省天然药物药理重点实验室,云南昆明650500;2.昆明医科大学分子临床研究院,云南昆明650500;3.云南中医学院基础医学院机能实验室,云南昆明650500)
重楼皂苷Ⅰ对人乳腺癌细胞MCF-7体内外生长的抑制作用
胡炜彦1,2*, 李 菊3, 贺智勇2, 付 昆1, 张荣平1*
(1.昆明医科大学药学院云南省天然药物药理重点实验室,云南昆明650500;2.昆明医科大学分子临床研究院,云南昆明650500;3.云南中医学院基础医学院机能实验室,云南昆明650500)
目的探讨重楼皂苷Ⅰ(PSI)对人乳腺癌细胞株MCF-7体内外生长的抑制作用及其作用机制。方法CCK-8法检测重楼皂苷Ⅰ对MCF-7体外生长的抑制作用,将其接种于正常小鼠左前肢腋窝皮下复制MCF-7荷瘤模型,然后分为模型对照组、环磷酰胺 (30mg/kg)组和PSI高、中、低剂量 (60、30、15 mg/kg)组,腹腔注射给药,每天1次,连续15 d。末次给药后处死小鼠,剥离完整的肿瘤组织,称定质量,计算肿瘤抑制率,Western blot法检测凋亡相关因子Bcl-2、Bax和Caspase-3表达。结果PSI可显著抑制MCF-7生长,高、中剂量重楼皂苷Ⅰ组的作用更为明显(P<0.01或P<0.05),抑制率分别为64.34%和39.86%。另外,以上两组还可明显下调Bcl-2、Bax,上调剪切型Caspase-3表达(P<0.01或P<0.05)。结论重楼皂苷Ⅰ对MCF-7生长具有抑制作用,其机制可能与调节Bcl-2、Bax和Caspase-3有关。
重楼皂苷Ⅰ;MCF-7;Bcl-2;Bax;Caspase-3
乳腺癌是发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤,目前其发病率逐年上升,已成为全球范围内女性最常见的恶性肿瘤之一,不仅严重威胁女性的身体健康和生活质量,而且给全球卫生系统带来沉重的负担,已成为当前社会的重大公共卫生问题[1-2]。如今乳腺癌的治疗手段主要是手术和化疗,而化疗药物效果在一定范围内与剂量成正比,随着用药剂量增加,发生不良反应的风险也随之上升。另外,手术治疗又会给患者带来巨大的经济负担和身心伤害。因此,从天然植物中寻找安全有效的抗肿瘤药物是近年来的研究热点,中药及其有效成分的相关研究也已经取得很大进展[3]。研究发现[4-5],中药活性成分能对乳腺癌细胞周期的相关基因和蛋白表达进行调控,直接或间接地影响细胞周期改变,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。同时,中药在预防乳腺癌及控制复发转移方面也有着不可忽视的作用。
重楼为百合科植物云南重楼Paris polyphylla Smith var. yunnanensis(Franch.)Hand.Mazz.或七叶一枝花Paris polyphylla Smith var.chinensis(Franch.)Hara的干燥根茎,有小毒,具有清热解毒、消肿止痛等功效,用于治疗疔疮痈肿、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打伤痛等症状,其活性成分主要是甾体皂苷[6]。本实验采用人乳腺癌细胞株MCF-7,建立小鼠荷瘤模型,观察重楼中的主要成分重楼皂苷Ⅰ(PSI)对MCF-7体内外生长的抑制作用,为乳腺癌治疗提供新的途径。
1 材料
重楼皂苷Ⅰ (PSI,云南植物药业有限公司研发中心,纯度为95%)。提取分离方法为云南重楼粗粉用75%乙醇提取,提取液减压浓缩后经大孔树脂柱层析,分离得到总皂苷类成分,再经正相和反相硅胶柱层析,即得;环磷酰胺 (CTX,云南省肿瘤病医院)。
清洁级C57小鼠60只,8周龄,雌雄各半,体质量18~22 g(昆明医科大学实验动物中心,动物使用许可证号SCXK[滇]-2011004)。
人乳腺癌细胞株MCF-7(中科院上海细胞生物学研究所),本实验室常规培养,生长于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液中,再置于37℃恒温,5%CO2饱和湿度条件下的培养箱中生长,取对数生长期细胞用于实验。
RPMI 1640培养基(美国Gibco公司);胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亚砜DMSO(中生华美北京科技有限公司);CCK-8试剂盒(美国Invitrogen公司);β-actin抗体(美国Sigma公司);Bcl-2、Bax抗体(美国BD公司);Caspase-3、cleaved Caspase-3抗体(美国Cell Signaling Technology公司);RIPA蛋白提取液(150 mmol/L NaCl、1.0%NP-40、0.5%脱氧胆酸钠、0.1%SDS、50 mmol/L Tris-HCl,pH为8,美国Thermo Fisher Scientific公司)。
2 方法
2.1 CCK-8检测PSI对乳腺癌细胞MCF-7体外生长的抑制作用 将培养好的MCF-7配成1×105个/mL密度的单细胞悬液,接种到96孔板上,每孔100μL,然后置于CO2培养箱中,37℃,5%CO2浓度下培养24 h。然后,将不同质量浓度的PSI溶液 (5、10、20、40、80、160μg/mL)和CTX溶液 (5、10,20、40、80、160μg/mL)依次加到预先铺好细胞的96孔板上,每孔100μL,设置3个平行孔。药物分别处理24和48 h后,每孔加入CCK-8溶液20μL,设置加入相应量细胞培养液、药物和CCK-8溶液,但没有加入细胞的孔作为试剂空白对照,在细胞培养箱内继续孵育1 h,450 nm下测定吸光度,计算各组细胞活力,公式如下。
各组细胞活力=各组吸光度/溶剂空白对照组吸光度×100%
2.2 复制荷瘤动物模型 将培养好的MCF-7配成1×107个/mL密度的单细胞悬液,取其中0.2 mL接种于正常小鼠左前肢腋窝皮下,制备荷瘤模型。
2.3 动物分组与给药 接种24 h后,将荷瘤小鼠随机分为5组,分别为模型对照组 (生理盐水)、CTX(30 mg/kg)组和PSI高、中、低剂量 (60、30、15 mg/kg)组。每天上午9点腹腔注射给药,给药量为20mL/kg,连续15 d。
2.4 抑瘤率的测定 末次给药24 h后,脱颈法处死小鼠,无菌条件下剥取完整的肿瘤组织,称定质量,并按下列公式计算抑瘤率。
抑瘤率 (%)=(1-给药组平均瘤质量/模型对照组平均瘤质量)×100%。
2.5 蛋白质表达的测定
2.5.1 蛋白质的提取 将各组肿瘤组织样本在冰块上充分碾磨后,置于1.5mL离心管中,加入蛋白裂解液 (1 mL/ 100 mg,使用前加入1%的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)。4℃下摇床震摇1 h,后离心15 min(4℃,13 000 r/m in),收集上清液。测定蛋白浓度后,将蛋白提取液按4∶1的体积比加入5×电泳样品缓冲液,沸水浴中煮5 min,使蛋白质充分变性,-80℃下储存备用。
2.5.2 蛋白质的测定 蛋白定量采用BCA试剂盒,按照说明书步骤操作,以BSA为标准测定蛋白浓度,用Model 2550 EIA reader在600 nm下读取OD值。
2.5.3 蛋白质的分离检测 5%浓缩胶和12%SDS-PAGE分离总蛋白,之后将蛋白质转移到PVDF膜,加入5%脱脂奶粉室温封闭2 h,封闭后的膜用TBST洗涤3次,加入一抗在4℃下孵育过夜,使抗原和抗体充分结合。接着,再用TBST洗涤3次,放入新杂交袋中,加入二抗以结合一抗,室温下孵育2 h,化学发光法进行检测,凝胶成像系统进行拍照成像,目的蛋白灰度值除以内参β-actin灰度值以校正误差,所得结果即为某样品的目的蛋白相对含量。
2.6 统计分析 所有数据均用x±s表示,并使用SPSS 11.0软件进行统计分析,采用单因素ANOVA(方差分析)法进行显著性检验。
3 结果
3.1 重楼皂苷Ⅰ(PSI)对乳腺癌细胞MCF-7体外生长的抑制作用 CCK-8法检测结果表明,与对照组相比,重楼皂苷Ⅰ对MCF-7具有明显的抑制作用,并呈一定的剂量依赖性。PSI处理24 h、48 h后的IC50分别为22.95、10.25 μg/mL;CTX处理24 h、48 h后的IC50分别为18.95、9.04 μg/mL,见图1。
图1 重楼皂苷Ⅰ和环磷酰胺对M CF-7细胞生长的抑制作用
3.2 重楼皂苷Ⅰ对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用 与模型对照组比较,PSI高、中剂量组的瘤质量显著减轻 (P<0.01或P<0.05),而且高、中、低剂量组的抑瘤率分别为64.34%、39.86%、20.28%,表明其对荷瘤小鼠的抑瘤作用呈剂量依赖性,见表1。
3.3 重楼皂苷Ⅰ对肿瘤组织中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达水平的影响 与模型对照组比较,重楼皂苷Ⅰ高、中剂量组Bcl-2、Bax水平明显降低(P<0.01或P<0.05),其剪切型Caspase-3水平明显上升 (P<0.05),总Caspase-3水平无明显变化,cleaved Caspase-3/Caspase-3比值显著增加 (P<0.01或P<0.05),见图2。
表1 PSI对模型小鼠的抑瘤作用(x±s,n=10)
图2 重楼皂苷Ⅰ对肿瘤组织中凋亡相关蛋白表达的影响 (n=3)
4 讨论
乳腺癌是严重危害女性健康的恶性肿瘤,统计数据表明,乳腺癌居女性癌症发病的第1位,死亡率居女性癌症死因的第6位,其患病率逐年上升,大中城市尤为突出[2,7]。目前,皂苷抗肿瘤机制为中药抗肿瘤研究热点之一。Cheng等[8]证实,大豆皂苷具有抗癌性。尤玲玲等[9]报道,苦瓜皂苷具有抗肿瘤细胞增殖的活性。重楼具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效,用于臃肿、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌打伤痛、凉风抽搐等症状的治疗。除此之外,它作为民间抗癌药,还广泛应用于治疗恶性淋巴瘤、肺癌、鼻咽癌、脑肿瘤及消化系统肿瘤等[10]。
重楼皂苷为重楼的主要活性物质,具有抗肿瘤、消炎、止血、抗氧化、促进子宫收缩和保护血管内皮细胞等药理作用。文献 [11]报道,它具有抗肿瘤及免疫调节作用,能显著抑制多种肿瘤细胞及移植瘤,并诱导其凋亡。PSI是从重楼中提取的甾体皂苷,研究表明它在体内外均具有很强的抗肿瘤作用[12-13]。
本实验对重楼皂苷Ⅰ体内外抑制乳腺癌MCF-7生长的情况进行了研究。CCK-8法检测结果显示,重楼皂苷Ⅰ在体外能显著抑制MCF-7生长,并呈一定的时间和剂量依赖性,处理24 h、48 h后的IC50分别为22.95、10.25μg/mL。另外,体内实验结果显示,PSI能显著抑制MCF-7荷瘤小鼠肿瘤的生长,高、中剂量重楼皂苷Ⅰ对其抑制率分别为64.34%、39.86%。Western blot法检测结果显示,与模型对照组相比,高、中剂量重楼皂苷Ⅰ可明显降低肿瘤组织中Bcl-2和Bax水平,同时上升剪切型Caspase-3水平。
诱导肿瘤细胞凋亡在肿瘤治疗中有着重要意义,已有许多研究证实,重楼抑制肿瘤细胞生长是通过凋亡途径来实现的。Xiao等[12]发现,重楼皂苷Ⅰ通过线粒体途径促进细胞凋亡,抑制裸鼠卵巢癌移植瘤模型的肿瘤生长。高冬等[14]报道,重楼可能是通过诱导癌细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用。Yan等[15]研究表明,重楼皂苷能显著诱导肺腺癌LA795细胞凋亡。本实验发现,重楼皂苷Ⅰ能够显著抑制MCF-7体内外生长,其机制可能是通过调节细胞凋亡蛋白表达,进而诱导细胞凋亡实现的,这将为乳腺癌的临床研究和开发新的抗乳腺癌药物提供实验基础。但是,由于本实验仅选择了一株人乳腺癌细胞株,相关指标不够全面,因此需要在以后实验中做更广泛深入的研究。
[1]方琼英,吴 琼,张秀玲,等.乳腺癌的流行现状分析[J].中国社会医学杂志,2012,29(5):333-335.
[2]黄哲宙,陈万青,吴春晓,等.中国女性乳腺癌的发病和死亡现况—全国32个肿瘤登记点2003-2007年资料分析报告[J].肿瘤,2012,32(6):435-439.
[3]顾琳慧,冯建国,钱丽娟,等.重楼皂苷Ⅰ对高转移人卵巢癌细胞体外生长抑制功能的研究[J].中华中医药学刊,2012,30(10):2212-2215.
[4]彭志刚,罗 军,赖永榕,等.芒果苷对白血病K562细胞周期分布及细胞周期素A、细胞周期素B1表达的影响[J].中华中医药杂志,2007,22(8):510-513.
[5]周瑞娟,陈红风.中药影响乳腺癌细胞周期的研究进展[J].肿瘤防治研究,2012,39(1):100-104.
[6]国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部[S].北京:中国医药科技出版社,2010:243.
[7]杨 坤,任建强.乳腺癌肿瘤标志物的研究现状及展望[J].临床和实验医学杂志,2011,10(21):1711-1713.
[8]Tsai C Y,Chen Y H,Chien YW,et al.Effect of soy saponin on the growth of human colon cancer cells[J].World J Gastroenterol,2010,16(27):3371-3376.
[9]尤玲玲,武 毅,何庆峰,等.苦瓜皂苷对人乳腺癌MCF-7细胞增殖作用的影响[J].时珍国医国药,2013,24(2):358-360.
[10]赵保胜,朱寅荻,马 勇,等.中药重楼研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(11):267-270.
[11]夏亚飞,阎 姝.重楼抗肿瘤作用机制研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(9):304-307.
[12]Xiao X,BaiP,BuiNguyen TM,et al.The antitumoraleffect of Paris SaponinⅠassociated with the induction of apoptosis through the mitochondrial pathway[J].Mol Cancer Ther,2009,8(5):1179-1188.
[13]顾琳慧,冯建国,钱丽娟,等.重楼皂苷Ⅰ对高转移人卵巢癌细胞体外生长抑制功能的研究[J].中华中医药学刊,2012,30(10):2212-2215.
[14]高 冬,高永琳,白 平.重楼对宫颈癌细胞钙信号的影响[J].福建中医学院学报,2003,13(4):26-28.
[15]Yan L L,Zhang Y J,Gao W Y,et al.In vitro and in vivo anticancer activity of steroid saponins of Paris polyphylla var. yunnanensis[J].Fxp Oncol,2009,31(1):27-32.
R966
:B
:1001-1528(2015)07-1582-04
10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.043
2014-03-12
云南省高校重点实验室基金项目 (2011YXZD07)
胡炜彦(1978—),女,硕士,讲师,从事药学教学科研工作。E-mail:huweiyan2004@163.com *通信作者:张荣平 (1964—),男,博士,教授,从事天然产物研究开发工作。E-mail:zhrp@163.com