内异康复片对子宫腺肌病小鼠雌激素效应因子P450arom、COX-2的时空变化影响

冯婷婷， 魏绍斌， 王宇慧， 解 娟

（1.成都中医药大学，四川成都610075；2.成都中医药大学附属医院妇科，四川成都610072）

内异康复片对子宫腺肌病小鼠雌激素效应因子P450arom、COX-2的时空变化影响

冯婷婷1， 魏绍斌2*， 王宇慧1， 解 娟1

（1.成都中医药大学，四川成都610075；2.成都中医药大学附属医院妇科，四川成都610072）

目的在临床应用内异康复片治疗子宫腺肌病取得明显疗效和前期实验研究的基础上，应用同种异体垂体移植方法建立子宫腺肌病动物模型，采用免疫组化技术检测P450arom、COX-2在治疗前后各组小鼠子宫在位及异位内膜上表达差异。方法选取8周龄ICR雌鼠62只，异体垂体移植方法造模，之后随机设模型组、内异康复片高、中、低剂量组、丹莪妇康煎膏组、孕三烯酮组。3个月后分别灌胃给药，持续3个月，免疫组化方法观察治疗前后子宫在位及异位内膜上P450arom、COX-2表达情况。结果P450arom、COX-2表达在不同治疗方法治疗后均下降，内异康复片高剂量组优于其他各治疗组，与模型组比较，具有显著差异 （P＜0.001），而且各组间比较均有统计学意义 （P＜0.01）。结论内异康复片能够通过下调在位及异位内膜雌激素效应因子P450arom、COX-2表达，阻断雌激素生成的正反馈环来抑制其产生，从而控制和治疗子宫腺肌病，缓解临床症状。

子宫腺肌病；内异康复片；P450 arom；COX-2

目前，子宫腺肌病 （AM）发病率日益增高，由于其发病机制复杂，临床难以治愈，严重影响患者生活质量，已成为妇科领域重点关注的问题［1］。

“瘀血内阻”为本病的核心病机已得到公认，其病理实质是 “离经之血”聚而成瘀，瘀阻冲任胞宫而发病。导致瘀血内停的常见病因有气滞、寒凝、湿热、痰凝、气虚、肾虚等［2-5］。本实验根据瘀血内阻和机体水湿运行代谢障碍之间的相关性，结合四川盆地独特的湿热型地理特点，以及本病病机的复杂性和病情的难治性，提出 “湿热瘀结”病机学说。同时，采用清湿化瘀法治疗本病，加以院内制剂内异康复片，临床应用5年已治疗AM患者5 000余例，经观察发现，它在缓解痛经及减少经量方面具有明显疗效［6］。本实验以雌激素效应为靶点，从不同时间和空间变化角度来探讨内异康复片对AM的作用机理。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物 选取已达到性成熟但未曾受孕的8周龄雌性ICR小鼠及同龄雄性ICR小鼠，体质量（28.0±3.0）g（成都简阳动物实验中心，批号SCXK［川］2004-11，合格证号川实动管质第8号）。

1.2 实验药物 内异康复片 （清湿化瘀法代表方），由大血藤、半枝莲、大黄、桃仁、土鳖虫、水蛭、三棱、莪术、鳖甲、牡蛎、浙贝、米仁组成 （四川省中医院制剂室）；孕三烯酮胶囊 （国药准字H19980020）；丹莪妇康煎膏 （国药准字Z20025253）。

1.3 动物模型的建立 采用异体垂体宫腔移植法建模。该方法在国外已较为成熟［7-9］，3%戊巴比妥钠为腹腔麻醉用药，用量30～35 mg/kg，给予8周龄雌鼠腹腔注射。分层切开雌鼠腹部皮肤层及皮下肌层，分离子宫，在膀胱下找到子宫分叉处。同时，处死雄鼠后开颅取出垂体组织，少许生理盐水混合，用自制套管针内芯将垂体生理盐水悬浊液0.5～1 mL缓慢推入雌鼠右侧子宫腔，然后针头及内芯同时退出，将子宫放回腹腔，腹腔内滴入庆大霉素溶液0.25 mL（1万U）预防感染，关腹。

1.4 实验分组及给药 选取8周龄ICR雌鼠和雄鼠，各62只，取其中12只作为正常组，其余采用异体垂体移植方法造模，术后死亡2只。常规饲养3个月后，随机取模型小鼠12只的异位组织送检，病检造模成功后再将其余48只随机分为模型组、内异康复片组、丹莪妇康煎膏组、孕三烯酮组。

正常组和模型组用蒸馏水 （0.4 mL/20 g）灌胃3个月。内异康复片高剂量组：中药浸膏用蒸馏水配成3.0 g/mL，稀释后每天灌胃1次（0.4 mL/20 g，28倍于人体常用剂量。中剂量组：中药浸膏用蒸馏水配成1.5 g/mL，稀释后每天灌胃1次 （0.4 mL/20 g，14倍于人体常用剂量）。低剂量组：中药浸膏用蒸馏水配成0.75 g/mL，每天灌胃1次 （0.4mL/20 g，7倍于人体常用剂量）。丹莪妇康煎膏用蒸馏水配成0.35mg/mL的水溶液，稀释后每天灌胃1次（0.14 g/20 g）。孕三烯酮用蒸馏水配成0.02 mg/mL的水溶液，每周灌胃2次 （0.4 mL/20 g）。连续给药3个月。

1.5 标本采集与处理方法 末次给药后24 h，颈椎脱臼处死小鼠，剖腹取出右侧子宫，将其依次固定、脱水、包埋、切片，并免疫组化SP染色。

1.6 检测方法 采用美国Media Cybernetics公司生产的Image-Pro Plus 6.0图像分析系统，在光学显微镜下分组观察。结果，在40倍及100倍视野下分别找到在位及异位内膜部位。同时，在200倍视野下选择含阳性物质 （即棕黄色颗粒物质）最多的5个区域浏览，先测量被覆上皮面积，再测量相应面积中阳性物质的积分光密度，用于代表各指标的表达情况。

1.7 统计学分析 所有数据均用SPSS 17.0统计软件进行处理，数据均以x±s表示，定量指标用单因素方差分析，组间比较用LSD、SNK分析和t检验。

2 免疫组化结果

2.1 雌激素效应因子P450arom随时空变化的表达 见表1。

表1 各组对小鼠子宫P450arom平均光密度值的影响(x±s,n=6)

2.2 雌激素效应因子COX-2随时空变化的表达 见表2。

表2 各组对小鼠子宫COX-2平均光密度值的影响(x± s,n=6)

2.3 实验结果

2.3.1 在位内膜 P450arom、COX-2水平在造模后升高，模型组高于正常组，而在治疗后两者水平均降低，内异康复片高剂量组下降程度高于其他各组，与模型组比较，差异有统计学意义 （P＜0.01），而且各组间比较也有显著性差异 （P＜0.01）。

2.3.2 异位内膜 P450arom、COX-2水平在造模后升高，而在治疗后两者水平均降低，内异康复片高剂量组下降程度高于其他各组，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），而且各组间比较也有显著性差异 （P＜0.01）。

3 讨论

3.1 内异康复片治疗靶点的讨论 在内异康复片中，大血藤、半枝莲清热解毒止痛；薏苡仁清热利湿排脓；大黄、桃仁活血导瘀下行；三棱、莪术、土鳖虫、水蛭破血逐瘀止痛；鳖甲、浙贝母散结消肿止痛。全方共奏清热解毒利湿，化瘀消癥止痛之功。本方容经方之义，参时方之效药，经时结合配伍严谨，力专效宏，是导师魏绍斌教授根据临床实践总结之经验方，充分展现了清湿化瘀法的要旨，在临床上广泛使用。经验证，其清湿化瘀止痛和止血疗效确切，故本实验将其作为清湿化瘀法的代表方。

COX-2又称前列腺素过氧化物合成酶，是PGE2合成的最主要限速酶之一，可将花生四烯酸转变为PGE2，而它则是P450合成的诱导因子，并可使其合成增加［10-11］。异常增多的P450在雌激素合成过程中作为限速酶，催化高水平和高生物活性的雌二醇 （E2）合成，而E2又能反过来刺激COX-2合成，提高其生物学活性。因此，从COX-2、PGE2、P450到E2，再到COX-2之间形成一个恶性循环的雌激素生成正反馈环［12-14］，加剧AM对雌激素依赖性的病理变化程度，同时促进异位内膜细胞的生长、侵袭、黏附、转移及增殖［6］。

本实验发现，经内异康复片各剂量组治疗后，雌激素效应因子P450、COX-2水平均有所下降，而且高剂量组与模型组比较，差异有统计学意义 （P＜0.01）。由此可知，内异康复片可有效改善AM的雌激素效应异常，从而达到治疗作用，它能通过降低在位及异位内膜雌激素效应因子P450 arom、COX-2表达，阻断雌激素生成的正反馈环来抑制其产生。因此可认为，雌激素效应因子P450 arom、COX-2为内异康复片的治疗靶点。

3.2 不同剂量内异康复片对观察指标的影响 本实验设置不同剂量的内异康复组进行对比，用于研究剂量对观察指标的影响。结果表明，高剂量内异康复片对雌激素效应因子的影响大于中剂量，但两者比较，无显著性差异 （P＞0.05），而高、中剂量组与低剂量组比较，差异均有统计学意义 （P＜0.05）。另外，内异康复片不同剂量组与模型组比较，也均有显著性差异 （P＜0.01）。由此可知，雌激素效应因子的调控程度与内异康复片的剂量相关，而且高剂量内异康复片的调控力大于中、低剂量。

3.3 不同治疗药物对观察指标的影响 本实验以中成药丹莪妇康煎膏和西药孕三烯酮为阳性药物，与内异康复片进行对照，用于探讨不同治疗药物对观察指标调控力的大小。

实验结果表明，内异康复片各剂量组和阳性药物组都能使观察指标在治疗后下降，与模型组比较，均有显著性差异 （P＜0.05）。其中，内异康复片高剂量组与模型组比较，差异有统计学意义 （P＜0.01），其疗效优于丹莪妇康煎膏组和孕三烯酮组。另外，各治疗组组间比较，也均有显著性差异 （P＜0.01）。由此可知，内异康复片高剂量组对在位及异位内膜雌激素效应因子P450arom、COX-2的影响高于丹莪妇康煎膏和孕三烯酮组，在有效改善雌激素效应异常的同时减少西药副作用，是值得深入研究的中药复方。

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R285.5

：B

：1001-1528（2015）07-1579-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.042

2014-08-17

国家自然科学基金项目 （81273796）

冯婷婷 （1987—），女，博士，从事中医药防治盆腔疼痛病症研究。Tel：13488972452，E-mail：232521259@qq.com

*通信作者：魏绍斌 （1957—），女，教授，主任医师，博士生导师，从事中医药防治盆腔疼痛病证研究。