益母草芳香族化合物对大鼠体外凝血功能影响

2015-01-16谢晓芳骆华刚杨雨婷

中成药 2015年7期

关键词：益母草凝血酶羟基

张雪，谢晓芳，熊亮，彭成，骆华刚，杨雨婷

（成都中医药大学药学院中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川成都611137）

益母草芳香族化合物对大鼠体外凝血功能影响

张雪，谢晓芳，熊亮，彭成*，骆华刚，杨雨婷

（成都中医药大学药学院中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川成都611137）

目的探讨益母草芳香族化合物对大鼠体外凝血功能和血小板聚集的影响。方法大鼠股动脉取血，3.8%枸椽酸钠-血液（1∶9）抗凝后离心（3 500 r/min），收集血浆，分组，然后按血浆与药物9∶1的体积比例分别加入1%二甲基亚砜（DMSO）、异欧前胡素（YMC-19）、对羟基苯甲酸乙酯（YMC-23）、4′-羟基-2，3-二氢肉桂酸二十四酯（YMC-38）、对羟基苯甲醛（YMC-40）、香草醛（YMC-41）、24R-5α-豆甾烷-3，6-二酮（YMC-42），血凝仪检测各组凝血酶原时间（PT）和活化部分凝血活酶时间（APTT）值。制备贫血小板血浆（PPP）和富血小板血浆（PRP），以PPP调零，将PRP加入比浊管中，再加入20μL受试药物溶液，以ADP 20μL（终质量浓度为0.05 mg/mL）诱导聚集，血小板聚集仪分别检测血小板最大聚集率。结果1×10-5mol/L的YMC-19、YMC-23、YMC-38均能显著延长PT时间（P＜0.05），其中YMC-23、YMC-38还能显著延长APTT时间（P＜0.05），但对血小板最大聚集率的影响不明显。结论YMC-23、YMC-38可能是益母草的活血成分，推测与抑制内外源凝血途径有关。

益母草；凝血；凝血酶原时间；活化部分凝血酶时间；血小板聚集

益母草为唇形科益母草属植物Leonurus japonicus Houtt.的新鲜或干燥地上部分［1］，原名茺蔚，始载于《神农本草经》，其味辛、微苦，性微寒，入心包、肝、膀胱经，具有活血化瘀、利尿消肿、清热解毒之功效。文献［2］报道，益母草中含有多种化合物，包括萜类、苷类、生物碱类、黄酮类、脂肪酸类、挥发油类等。现代药理学研究表明［3-4］，它具有溶栓、抗凝、降脂、降血黏度、降低红细胞聚集、抑制血小板聚集、改善微循环、抗氧自由基等诸多作用。课题组前期从益母草药材提取物中已分离得到芳香族化合物欧前胡素（YMC-19）、对羟基苯甲酸乙酯（YMC-23）、二十五烷基3-（4-羟基苯基）丙酸酯（YMC-38）、4-羟基苯甲醛（YMC-40）、香草醛（YMC-41）和24R-25α-豆甾烷2，6二酮（YMC-42），其中YMC-38为首次发现的新化合物，而其他化合物则是首次从益母草中发现。另外，所有化合物均经过高效液相色谱仪和核磁共振技术分析，并对其结构进行了鉴定，纯度均达99%以上，除YMC-23和YMC-42外，其他化合物的相关化学研究均已发表报道［5］。本实验主要从凝血和血小板聚集功能的方面来探讨这些芳香族化合物的活血作用。

1 实验材料

1.1 实验药物 YMC-19、YMC-23、YMC-38、YMC-40、YMC-41、YMC-42均由成都中医药大学中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地提取分离获得，纯度均达99%以上。二甲基亚砜（DMSO）将其配置成1×10-2mol/L的贮备液，-10℃下保存，使用前用生理盐水稀释成1×10-4mol/L。

1.2 实验动物 SD大鼠，清洁级，雌雄不拘，体质量200～240 g，由成都中医药大学实验动物研究中心提供，生产质量合格证号SCXK（川）2008-11。

1.3 主要仪器 CA-500系列全自动血凝仪（日本Sysmex公司）；APACT/2型多通道血小板聚集仪（德国兰波公司）。

1.4 主要试剂 PT、APTT试剂盒（上海太阳生物技术有限公司，批号105197、112133）；二磷酸腺苷二钠（adenosine-5′-diphosphate，ADP，美国 Sigma公司，批号SLBB1854）；阿司匹林肠溶片（云南白药集团股份有限公司，批号ZFA1401）；肝素钠（中国惠世生化试剂有限公司，批号090508）。

2 实验方法

2.1 大鼠体外血浆凝血酶原时间（PT）和活化部分凝血酶时间（APTT）影响实验取健康成年的SD大鼠，雌雄不拘，适应环境后股动脉采血，3.8%枸椽酸钠-血液（1∶9）抗凝，离心10 m in（3 500 r/min），收集血浆后分为8管，按血浆与药物9∶1的体积比例向8管中分别加入1%DMSO、YMC-19、YMC-23、YMC-38、YMC-40、YMC-41、YMC-42，其药物终浓度为1×10-5mol/L，阳性对照为肝素钠（35 U/mL），混匀后温育5 m in，全自动血凝仪测定各组PT和APTT值。

2.2 ADP诱导的大鼠血小板聚集的影响实验取健康成年的SD大鼠，雌雄不拘，适应环境后股动脉采血，3.8%枸椽酸钠-血液（1∶9）抗凝，离心10 min（800 r/min），制备富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP），剩余部分再离心10 m in（4 000 r/min），制备贫血小板血浆（plateletpoor plasma，PPP）。以PPP调零，取200μL PRP加入比浊管中，37℃下温育5 min，然后加入20μL受试药物溶液，使阿司匹林、YMC-19、YMC-23、YMC-38、YMC-40、YMC-41、YMC-42的终浓度均为1×10-5mol/L（空白组加入1%DMSO溶液20μL），混匀后继续温育5 min。然后加入ADP 20μL（终质量浓度为0.05 mg/mL）诱导聚集，血小板聚集仪检测血小板最大聚集率。

2.3 统计学方法实验数据采用SPSS 19.0统计，实验结果以（x±s）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为具有统计学意义。

3 结果

3.1 对大鼠体外血浆凝血酶原时间（PT）和活化部分凝血酶时间（APTT）的影响与溶剂对照组比较，YMC-19、YMC-23和YMC-38的凝血酶原时间（PT）均明显延长，具有显著性差异（P＜0.05）；YMC-23、YMC-38和YMC-41的活化部分凝血酶时间（APTT）也均显著延长（P＜0.05或P＜0.01）。另外，实验结果还显示，YMC-19、YMC-23、YMC-38和YMC-41具有一定的抗凝血活性，其中YMC-23和YMC-38可能是益母草的活血物质，见表1。

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表1 益母草芳香族化合物对大鼠体外凝血功能的影响(x±s)

3.2 对ADP诱导的大鼠血小板聚集的影响 YMC-19、YMC-23、YMC-38、YMC-40、YMC-41、YMC-42在终浓度为1×10-5mol/L时，对体外ADP诱导的血小板最大聚集率均低于溶剂对照组，但不具有显著性差异（P＞0.05），即无明显抑制作用，见表2。

表2对ADP诱导的体外血小板聚集的影响(x±s,n=10)

4 讨论

《本草纲目》记载，益母草 “行血养血，行血而不伤新血，养血而不滞瘀血，诚为血家之圣药也”，被视为治疗月经不调、胎漏难产、产后恶露不尽、瘀血腹痛等妇科疾病的常用良药。研究发现，益母草还能抗菌［6］、降血脂［7］、抗肿瘤［8］等，而益母草水苏碱则可明显减少去甲肾上腺素（NE）诱导的肥大心肌细胞表面积［9］。益母草中的化学成分是其发挥药理作用的主要物质基础，除含有生物碱、黄酮、二萜、糖苷、脂肪酸、挥发油、环型多肽外，还含有锌、铜、锰、铁等多种微量元素［10］。研究表明，该植物中的一些化合物与活血作用相关，其中益母草碱和水苏碱有非常显著的降血黏作用，同时益母草碱中的胍基结构可抗血小板凝聚，常用作质控指标［11］；二萜类成分前益母草素是一种血小板活化因子（PAF）的拮抗剂，能竞争性抑制血小板上的PAF受体，从而产生抗凝作用［12］；从益母草果实中分离得到的环九肽Cycloleonuripeptide E和Cycloleonuripeptide F对大鼠动脉有中等强度的血管舒张作用［13］。本实验对益母草中的欧前胡素、对羟基苯甲酸乙酯、二十五烷基3-（4-羟基苯基）丙酸酯、4-羟基苯甲醛（YMC-40）、香草醛和24R-25α-豆甾烷2，6二酮这6种芳香族化合物进行体外凝血功能和血小板聚集研究，结果发现它们均能延长大鼠体外血浆凝血酶原时间（PT）和活化部分凝血酶时间（APTT），其中对羟基苯甲酸乙酯和二十五烷基3-（4-羟基苯基）丙酸酯的作用更显著。另外，以上6种化合物对大鼠血小板聚集也均有影响。

目前对药物作用于血管系统的研究主要集中在血液流变学、抗凝血和抗血栓方面。血液流变学的主要指标是全血黏度、血浆黏度、红细胞聚集指数等，其水平的增高是导致血液高黏滞及血栓形成的重要原因。其中，全血黏度增高是血液高黏滞的根本因素，主要与红细胞聚集增强有关，而低切变率下的全血黏度可在一定程度上反映红细胞的聚集能力；血浆黏度增高也是导致高黏滞的原因之一，与血浆无形成分的改变有关［14］。

益母草注射液能减少红细胞、血小板、纤维素和白细胞在小血管内壁中的聚集，并使红细胞压积、全血比黏度低切部分、全血还原比黏度低切部分和黏度指数显著降低［15］。血小板和凝血因子在止血和血栓形成过程中起着重要作用，而血小板是一期止血的基础，可以给凝血系统活化及凝血酶最终形成提供磷脂表面，在血液凝固中具有重要作用。正常的凝血系统是二期止血的重要保障，PT、APTT、凝血酶时间（TT）和纤维蛋白原含量测定（Fg）是筛选凝血系统有无异常的重要指标。其中，APTT可显示内源途径凝血因子的活性，而PT则能反映外源性凝血途径的活性。本实验表明，益母草中的欧前胡素、对羟基苯甲酸乙酯和二十五烷基3-（4-羟基苯基）丙酸酯能明显延长PT时间，其中后两者能明显延长APTT时间，说明它们对内外源型凝血途径有明显的抑制作用。但是，以上3种化合物对血小板聚集的抑制作用均不明显。

综上所述，从益母草中提取的芳香族化合物有一定的抗凝血作用，其中对羟基苯甲酸乙酯和二十五烷基3-（4-羟基苯基）丙酸酯可能是抗凝血的主要成分，推测与抑制内外源凝血途径有关，但具体作用机制尚不清楚。另外，本实验未涉及血液流变学方面，故仍需作进一步深入研究。参考文献：

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［7］钱海兵，徐玉平，罗魁.益母草碱对实验性高脂血症大鼠的降脂作用［J］.华西药学杂志，2012，27（5）：528-530.

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