不同产地苦碟子中活性成分的测定

吴晶晶， 李国辉， 王贝贝， 顾 星， 李天祥， 李庆和

（天津中医药大学，天津300193）

不同产地苦碟子中活性成分的测定

吴晶晶， 李国辉， 王贝贝， 顾 星， 李天祥*， 李庆和

（天津中医药大学，天津300193）

目的考察不同产地苦碟子中主要活性成分的含有量。方法采用UV-VIS法测定总黄酮，RP-HPLC法定量测定腺苷、木犀草素和芹菜素。结果总黄酮平均含有量为 （53.498 1±9.397 0）mg/g，其中以河北承德为最高（71.833 0 mg/g）；腺苷平均含有量为 （0.145 1±0.098）mg/g，其中以陕西咸阳为最高（0.326 9 mg/g）；木犀草素平均含有量为 （0.086 0±0.034 275）mg/g，其中以内蒙赤峰为最高 （0.155 5 mg/g）；芹菜素平均含有量为（0.006 0±0.003 511）mg/g，其中以陕西咸阳为最高 （0.012 5mg/g）。结论不同产地苦碟子药材活性成分含有量差异较大。

苦碟子；产地；总黄酮；腺苷；木犀草素；芹菜素

苦碟子来源于菊科植物抱茎苦荬菜Ixeris sonchifolia（Bge.）Hance的地上部分，为二年生草本植物。以干燥全草入药，其味苦、性微寒，具清热祛火、消炎解毒、凉血消肿、祛瘀止痛、补虚止咳之功效；民间主要用于治疗阑尾炎、扁桃体炎、无名肿痛等症［1］。主要含有黄酮类、腺苷类、三萜类和倍半萜内酯类等成分，其中黄酮类和腺苷类为主要活性成分［2］。现代药理研究表明，苦碟子具有保护心脑血管系统、抗肿瘤、抗病毒、调节血脂等作用［3-10］。目前，苦碟子的质量评价主要考察某单一成分含有量或某一省区不同产区的含有量［11-13］；且 《中国药典》未收录此药，其还没有统一的质量评价标准。为保证质量，可以从多成分、多产地较全面地对苦碟子进行成分定量考察，并进行分析评价。本研究以苦碟子主要活性成分总黄酮、腺苷、木犀草素和芹菜素为指标，对全国主要产地天津 （蓟县）、陕西 （咸阳、榆林）、山西（长治、永济）、河南 （信阳狮河港、林州、桐柏）、内蒙 （赤峰）、辽宁 （丹东）以及河北 （易县、承德）7个产区、12个不同产地苦碟子地上部分进行主要成分定量测定，为进一步研究、开发苦碟子提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 紫外-可见分光光度计 （上海美普达有限公司），Alltech 1500系列Q05型高效液相色谱仪 （UV 1000型全波段可编程紫外检测器），FA 2104N电子天平 （上海舜宇恒平科技仪器有限公司），SB25-12DJ超声波清洗机 （宁波新芝生物科技股份有限公司），FZ-6050型真空干燥箱 （上海新苗医疗器械制造有限公司）。

1.2 试药 对照品芦丁 （批号MUST-12040302）；腺苷 （批号110879-200202）；木犀草素 （批号MUST-11051001）；芹菜素 （批号MUST-10031801）购自国家食品药品检定研究院。石油醚、磷酸、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠为分析纯；甲醇、乙腈为色谱纯；市售娃哈哈纯净水；蒸馏水。药材采自12个产地，原植物经天津中医药大学李天祥副教授鉴定为菊科植物抱茎苦荬菜Ixeris sonchifolia（Bge.）Hance地上部分。

2 方法与结果

2.1 苦碟子总黄酮测定

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒定质量的芦丁对照品25.71 mg，置25 mL量瓶中，用70%乙醇溶解并定容，摇匀，即得 1.028 4 mg/mL对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取苦碟子粉末 （过60目筛）约0.5 g，精密称定，加90 m L石油醚索氏回流2 h至无色，弃去石油醚，药渣挥去石油醚，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，称定质量，超声提取50 min，放冷，再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，离心5 min，取上层离心液，即得供试品溶液。

2.1.3 线性关系考察和标准曲线的制备 精密吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL对照品溶液于10 mL量瓶中制成一系列标准溶液。分别加入70%乙醇1 mL，加5%亚硝酸钠0.4 mL摇匀，静置6 min，再加5%硝酸铝0.4 mL摇匀，静置6 min，再加5%氢氧化钠试液4.0 mL，用70%乙醇稀释至刻度摇匀，静置15 min后，以70%乙醇溶液作为参比溶液，照紫外-可见分光光度法 （《中国药典》2010年版一部附录VA），在505 nm波长处测定吸光度。以吸光度对溶液质量浓度进行回归分析，结果在20.57～71.99μg/mL范围内呈良好线性关系。回归方程y=12.533 3x-0.007 9（r= 0.999 3）。

2.1.4 测定方法 精密量取供试品溶液0.5 mL，置于10 m L量瓶中，分别加入70%乙醇1 mL，照“2.1.3”项下显色方法操作，在505 nm波长处测定吸光度。根据标准曲线，计算出苦碟子中总黄酮的量。

2.1.5 精密度试验 取对照品溶液适量，按“2.1.3”项下方法，连续测定6次吸光度。RSD为0.03%。

2.1.6 稳定性试验 取同一供试品溶液，于0、20、40、 60、 80、 100、 120 min 测定， 按“2.1.3”项下方法测定其吸光度，结果RSD为1.7%，表明供试品溶液显色后在2 h内稳定。

2.1.7 重复性试验 取天津产苦碟子样品6份，按 “2.1.2”项下方法制备，按 “2.1.3”项下方法测定吸光度，结果RSD为0.9%。

2.1.8 加样回收试验 精密称取已知成分含有量天津产苦碟子药材0.25 g，精密称定，6份，分别精密加入芦丁对照品溶液（1.028 4 mg/mL）适量，加90 m L石油醚索氏回流2 h至无色，弃去石油醚，药渣挥去石油醚，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，称定质量，超声提取50 min，放冷，再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，离心5 min，取上层离心液，精密吸取0.25 mL，置10 mL量瓶中，照“2.1.4”项测定法项下的方法，依法测定吸光度，计算回收率。结果显示平均回收率为103.0%，RSD值为1.5%，见表1。

表1 总黄酮加样回收率试验结果Tab.1 Results of recovery tests for total flavonoids

2.2 苦碟子中腺苷测定

2.2.1 色谱条件 Welch Ultimate C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为甲醇-水（13∶87）；体积流量1 mL/min；柱温为室温；检测波长260 nm；进样量20μL。色谱图见图1。

图1 腺苷对照品(A)和样品(B)HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram s of reference adenosine(A)and sam p le(B)

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒定质量的腺苷对照品7.28 mg，置10 m L量瓶中，用纯净水溶解并定容，摇匀，即得0.728 mg/mL对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取苦碟子粉末 （过60目筛）约0.2 g，精密称定，置于5mL量瓶中，精密加入纯净水5 mL，称定质量，超声提取40 min，在85℃下水浴加热10 min，放冷，再称定质量，用纯净水补足减失的质量，摇匀，离心5 min，取上层离心液，用微孔滤膜 （0.45μm）滤过，取续滤液即得。

2.2.4 线性关系考察 精密量取对照品溶液，稀释成质量浓度分别为 0.728、2.912、5.096、

7.280 、9.460、11.648、13.832 μg/mL。 按“2.2.1”项下色谱条件测定峰面积。以峰面积（y）为纵坐标，对照品质量浓度（x）为横坐标作图，得回归方程：y=36 838x-1 683.5，r=0.999 7，表明腺苷在0.728～13.832μg/mL范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.2.5 精密度试验 取对照品溶液，按 “2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，计算 RSD值为1.1%。

2.2.6 稳定性试验 取天津产苦碟子样品，按“2.2.3”项下方法制备，并且按 “2.2.1”项色谱条件下每隔1.3 h测定其峰面积，测定6次，其RSD值为2.4%，表明样品在8 h之内测定稳定。

2.2.7 重复性试验 取天津产苦碟子样品6份，在 “2.2.3”项下方法制备，按 “2.2.1”项下色谱条件下测定峰面积，RSD值为0.8%。

2.2.8 加样回收试验 精密称取已知成分含有量天津产苦碟子药材0.1 g，精密称定，6份，分别加入腺苷对照品溶液（0.728 mg/mL）适量，置于5 mL量瓶中，精密加入纯净水5 mL，称定质量，超声提取40 min，在85℃下水浴加热10 min，放冷，再称定质量，用纯净水补足减失的质量，摇匀，离心5 min，取上层离心液，用微孔滤膜 （0.45μm）滤过，取续滤液即得。在“2.2.1”项下色谱条件测定峰面积，计算回收率。结果显示平均回收率为100.8%，RSD值为2.4%，见表2。

表2 腺苷加样回收率试验结果Tab.2 Results of recovery tests for adenosine

2.3 苦碟子中木犀草素与芹菜素测定

2.3.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱（2）（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为甲醇-0.2%磷酸（0～16 min，52%A；16～25 min，52%～85%A）；体积流量1 m L/min；柱温为室温；检测波长336 nm；进样量20μL。色谱图见图2。

图2 混合对照品(C)和样品(D)HPLC色谱图Fig.2 HPLC chrom atogram s of m ixed reference substances(C)and sam p le(D)

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取木犀草素、芹菜素对照品适量，置于10mL量瓶，用甲醇溶解定容至刻度，摇匀，得木犀草素0.228 mg/mL、芹菜素0.024 5 mg/mL的对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备 取苦碟子粉末 （过60目筛）1.0 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入90%乙醇25 mL，超声提取30 min，静置，吸取上清液。重复以上操作两次，合并上清液，过滤，减压浓缩至干，残渣加甲醇使溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.3.4 线性关系考察 精密量取对照品溶液适量，稀释成木犀草素的质量浓度分别为2.28、9.12、15.96、22.80、29.64、36.48、43.32μg/mL，芹菜素的质量浓度分别为0.245 0、0.857 5、1.470 0、2.082 5、2.695 0、3.307 5μg/mL。按 “2.3.1”项下色谱条件进行测定。以峰面积 （y）为纵坐标，进样质量浓度（x）为横坐标作图，回归方程：木犀草素y=42 624.570 1x-46 957.087 3，r=0.999 4；芹菜素y=56 975.455 8x-1 437.208 9，r=0.999 0。结果显示，木犀草素、芹菜素分别在2.28～43.32 μg/mL、0.245 0～3.307 5μg/mL范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.3.5 精密度试验 取混合对照品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件连续进样6次，计算木犀草素、芹菜素峰面积RSD值分别为0.4%、0.7%。

2.3.6 稳定性试验 取天津产苦碟子样品，按“2.3.3”项下方法制备，并且按 “2.3.1”项下色谱条件每隔2.5 h测定其峰面积，测定10次，其木犀草素、芹菜素RSD值分别为0.6%、2.8%，表明样品在25 h之内测定稳定。

2.3.7 重复性试验 取天津产苦碟子样品6份，在 “2.3.3”项下方法制备，按 “2.3.1”项下色谱条件下测定峰面积，木犀草素、芹菜素RSD值分别为1.2%、2.5%。

2.3.8 加样回收试验 精密称取已知含有量天津产苦碟子药材0.5 g，精密称定，6份，分别加入木犀草素对照品溶液（0.228 mg/mL）和芹菜素对照品溶液（0.0245 mg/m L）适量，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入90%乙醇25 mL，超声提取30 min，静置，吸取上清液。重复以上操作两次，合并上清液，过滤，减压浓缩至干，残渣加甲醇使溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，即得。在 “2.3.1”项下色谱条件测定峰面积，计算回收率。结果显示木犀草素、芹菜素平均回收率分别为97.1%、99.2%，RSD值分别为2.1%、2.6%，见表3。

2.4 样品测定 取不同产地苦碟子样品，按“2.1”项、“2.2”项、“2.3”项下制备供试品溶液并测定，结果见表4。

表3 木犀草素与芹菜素加样回收率试验结果Tab.3 Results of recovery tests for luteolin and apigenin

表4 样品测定结果(n=3)Tab.4 Determ ination resu lts of samples(n=3)

3 讨论

3.1 脱脂溶剂的选择 本实验测定苦碟子中总黄酮，用索氏提取并脱脂，对比了三氯甲烷与石油醚的脱脂效果，结果表明三氯甲烷与石油醚脱脂后，总黄酮的含有量差异不明显，且三氯甲烷脱脂时间较长，毒性较大，故本实验采用石油醚脱脂。

3.2 提取方法的选择 本实验测定苦碟子中腺苷，考察了回流提取、超声提取和先超声后水浴保温的方法，结果表明先超声后水浴保温方法，方法学验证结果较优，测定的质量分数高，因此本实验选择先超声后水浴保温方法提取苦碟子中的腺苷。

3.3 检测波长的选择 本实验测定苦碟子中木犀草素和芹菜素时，对木犀草素与芹菜素分别进行了全波长扫描，木犀草素最大吸收波长为348.5 nm和336 nm，芹菜素为335.5 nm，故选择对木犀草素和芹菜素均有较好响应的波长336 nm作为检测波长。

3.4 流动相的选择 在测定木犀草素和芹菜素时，先后考察了甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸，乙腈-0.2%磷酸流动相系统进行梯度洗脱，经比较，采用甲醇-0.2%磷酸作为流动相，基线稳定，色谱图分离效果最好。

3.5 结果分析 根据定量测定结果可知，其中总黄酮量最高的产地为河北承德达71.833 0 mg/g，腺苷、芹菜素以陕西咸阳最高，分别为0.326 9 mg/g、0.012 5 mg/g，木犀草素内蒙赤峰最高为0.1555 mg/g。不同产地苦碟子药材中总黄酮、腺苷、木犀草素和芹菜素含有量差异较大，这可能与产地、气候条件、土壤环境等条件有关。

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Determ ination of active constituents in Ixeris sonchifolia（Bge.）Hance from different grow ing areas

WU Jing-jing， LIGuo-hui， WANG Bei-bei， GU Xing， LITian-xiang*， LIQing-he
（Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

AIMTo study the contents of active constituents in Ixerissonchifolia from differentgrowing areas.METHODSUV-VISmethod was used to determine the content of total flavonoids，and using RP-HPLCmethod to determine the contents of adenosine，luteolin and apigenin.RESULTSThe average contentof total flavonoids was 53.498 1±9.397 0 mg/g，the highestwas71.833 0 mg/g in Chengde District，Hebei Province；the average adenosine contentwas0.145 1±0.098 mg/g，the highestwas0.326 9 mg/g in Xianyang District，Shanxi Province；the average luteolin contentwas 0.086 0±0.034 275 mg/g，the highestwas 0.155 5mg/g in Chifeng District，Inner Monglia Area；the average apigenin contentwas 0.006 0±0.003 511 mg/g，the highestwas0.012 5 mg/g in Xianyang District，Shanxi Province.CONCLUSIONThere are significant differences in contents of active constituents in Ixeris sonchifolia among different growing areas.

Ixeris sonchifoia（Bge.）Hance；growing area；total flavonoids；adenosine；luteolin；apigenin

R284.1

：A

：1001-1528（2015）07-1538-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.031

2014-08-22

生多调查 （环）：第四次全国中药资源普查天津试点；天津市科技支撑计划项目 （10ZCZDSY12400）

吴晶晶 （1989—），女，硕士生，主要从事中药质量控制与资源开发研究。Tel：15900259817，E-mail：1056995200@ qq.com

*通信作者：李天祥（1966—），男，博士，副教授，Tel：（022）59596262，E-mail：litianxiang612@sina.com