炮制对蒺藜皂苷类成分的影响

李瑞海， 冯 琳， 马欣悦， 刘书平， 孙延君， 贾天柱（辽宁中医药大学药学院，辽宁大连116600）

[饮片炮制]

炮制对蒺藜皂苷类成分的影响

李瑞海， 冯 琳， 马欣悦， 刘书平， 孙延君， 贾天柱（辽宁中医药大学药学院，辽宁大连116600）

目的测定炮制前后蒺藜的皂苷成分含有量并推测其炮制机理。方法蒺藜甲醇提取液的正丁醇部位的HPLC分析采用Ultimate LP-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流动相为甲醇-水（80∶20），检测波长203 nm；采用高氯酸作显色剂，蒺藜皂苷元为指标，测定蒺藜总皂苷。结果蒺藜皂苷元在0.82～7.38μg和24.6～86.1μg有良好的线性关系，平均回收率分别为99.3%和100.7%。蒺藜经清炒法、烘制法炮制后，其总皂苷含有量下降，皂苷元含有量增加。结论实验结果表明，蒺藜烘制与清炒作用相同，其机理可能为其皂苷经炒制转化为结构性质更为稳定的蒺藜皂苷元成分。

蒺藜；炒制；烘制；蒺藜皂苷元；比色法；炮制机理

蒺藜为蒺藜科蒺藜Tribulus terrestris L.的干燥成熟果实。具有平肝解郁、活血祛风、明目、止痒之功效［1］，临床常用于头痛眩晕、胸胁胀痛、乳闭乳痈、目赤翳障、风疹瘙痒［2］。其性味辛、苦，微温；有小毒。归肝经。有报道蒺藜的嫩茎鲜品被马、羊等动物食后会引起中毒，但晒干后可作为药物使用，而且经炮制后应用于临床［3-4］，提示蒺藜经一定方法处理后可能存在 “减毒增效”的作用，目前尚无相关报道。经查阅文献和历版 《中国药典》发现，蒺藜多为火制。蒺藜火制方法始于唐代，有 “烧”、“炒焦”、“炒 （杵）去刺”、“熬”等。宋代火制方法有 “微炒”、 “熬令黄”等，酒制方法有 “酒蒸”、“酒炒”。《中国药典》2010年版规定蒺藜炮制为 “炒蒺藜，取净蒺藜，照清炒法 （附录ⅡB）炒至微黄色”［5-7］。本研究拟采用传统 “炒法”，对蒺藜进行炮制。又因为 “炒”制的过程主要的影响因素是温度的高低和作用时间长短的不同，因此本研究拟采用烘箱烘制蒺藜辅助说明“炒”制的作用。参考已发表文献 ［8-14］，本研究拟采用传统 “炒”法和烘制法，并利用HPLC法、比色法，对蒺藜成分在炮制前后的变化进行对比研究，初步说明 “炒”制蒺藜的炮制机理。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 Agilent 1100 Series高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司），安捷伦色谱工作站；U-3010紫外分光光度计 （日本日立公司）UV Solutions 2.1工作站，十万分之一电子天平 （德国赛多利斯公司）。

1.2 试药 蒺藜皂苷元TTS对照品 （25R-spirostan-4-ene-3，12-dione）（本实验室分离纯化，纯度＞98%）；高效液相色谱用水为蒸馏水，甲醇为色谱纯；其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 蒺藜皂苷元HPLC测定

2.1.1 色谱条件 Welch Ultimate LP-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为甲醇-水（80∶20），体积流量1.0 mL/min；检测波长203 nm；柱温30℃［8-9］。

2.1.2 供试品溶液制备 取蒺藜药材，粉碎，精密称取1 g，加甲醇10 m L，加热回流处理3次，每次1 h。过滤，合并滤液，蒸干。加甲醇转移并定容至10 mL量瓶中，经0.45μm微孔滤膜过滤，备用。

2.1.3 对照品溶液制备 精密称定蒺藜皂苷元（25R-spirostan-4-ene-3，12-dione）对照品适量，配成0.123 mg/mL溶液，备用。

2.1.4 测定结果 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液20μL。依次进样，在上述色谱条件下测定，记录色谱图，如图1。

图1 蒺藜皂苷元(A)及样品(B)的色谱图Fig.1 HPLC chromatogram s of Tribulus terrestris saponins(A)and sam p le(B)

2.2 蒺藜总皂苷的比色法测定

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取蒺藜皂苷元对照品加甲醇配制成0.123 mg/mL。

2.2.2 供试品溶液的制备 取蒺藜药材约0.5 g，粉碎过筛 （细粉），精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇溶液50 mL，称定质量，加热回流处理2 h，取出放冷，再称定质量，用甲醇补足质量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液25 mL，回收溶剂至干，残渣加水10mL溶解，用水饱和正丁醇振摇提取5次，每次10 mL，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次5 mL，弃去氨试液，正丁醇液蒸干。残渣加80%甲醇溶解，转移至50 mL量瓶中，加80%甲醇至刻度，摇匀。

2.2.3 样品总皂苷测定 精密量取供试品2 mL，置于10 mL具塞试管中，水浴挥干甲醇，加高氯酸5.0 mL，60℃水浴保温15 min，以不加样品的高氯酸溶液为空白对照，在285 nm波长下进行吸光度的测定，根据回归方程计算样品溶液总皂苷的量。

2.3 方法学考察

2.3.1 HPLC法标准曲线 精密称取蒺藜皂苷元对照品加甲醇配制成0.41 mg/mL，分别精密量取1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL，以甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中，分别量取20μL，注入HPLC色谱仪中，结果得回归方程：y=264.947x-8.693，r=0.999 7，表明在0.82～7.38μg范围内线性关系良好。

2.3.2 比色法标准曲线 分别吸取0.123 mg/mL对照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，置于10 mL具塞试管中，挥干溶剂，加高氯酸溶液5 mL，60℃水浴保温15 min，取出后立即冰水浴冷却至室温，摇匀，在285 nm测定对照品吸收度A，结果得线性方程y=0.008 6x-0.043 1，r= 0.999 2，表明在24.6～86.1μg范围内线性关系良好。

2.3.3 精密度试验 取对照品溶液，在 “2.1”、“2.2”项条件下，连续测定6次，结果RSD值分别为1.1%、1.2%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 HPLC法所制样品于10 h内测定RSD为1.3%，比色法于1 h内测定RSD为 0.7%，供试品溶液相对稳定。

2.3.5 重复性试验 取样品分别按 “2.1”、“2.2”项条件下进行处理，结果RSD值分别为1.0%、1.1%，表明方法重复性良好。

2.3.6 回收率试验 精密称取蒺藜样品1 g，加1.23 mg/mL对照品溶液1 mL，按“2.1.2”项下方法处理，按 “2.1.1”项下条件进行测定。精密称取蒺藜样品0.5 g，加入1.0 mL对照品溶液（9.81 mg/mL），按 “2.2.2”项处理，按 “2.3”项显色后，于285 nm下测定，结果表明方法回收率试验结果良好，具体见表1。

表1 HPLC法(比色法)回收率试验结果Tab.1 Results of recovery tests

2.4 蒺藜炮制品制备

2.4.1 清炒 蒺藜置炒锅内，文火加热，不断翻炒，至药物表面呈黄色，取出，放凉，即得。

2.4.2 烘制 蒺藜置电热鼓风恒温干燥箱内，分别于120、140、200℃各烘制35 min。将上述样品、生品置于干燥器内，放置24 h后，备用。

2.5 蒺藜皂苷、蒺藜皂苷元测定结果 按前述方法，对6个样品进行测定，结果见表2。

表2 样品测定结果Tab.2 Test resu lts of six sam ples

3 讨论与结论

本实验结果表明，蒺藜传统炮制过程清炒法，其炮制结果为总皂苷下降，蒺藜皂苷元TTS的含有量有所增加。实验结果也表明烘制法具有相同的作用结果，蒺藜经烘制后，蒺藜总皂苷含有量下降，而蒺藜皂苷元TTS的含有量有显著增加，其中以烘制200℃，35 min最为明显，增加了近15倍。

本课题其他实验内容表明蒺藜皂苷元TTS具有较强的生物活性作用，因此，对于获得更多的蒺藜皂苷元TTS成分，烘制法具有方法简便易行，条件容易控制等优势。可在本实验的基础上，经过进一步实验后，确定烘制法作为炒制的替代炮制方法的可行性。

根据本实验的结果，初步分析蒺藜经炮制其成分变化的过程为皂苷转化为结构性质更为稳定的蒺藜皂苷元成分。蒺藜含有大量的皂苷类成分，其结构特点是多为甲基原薯蓣皂苷元双糖链皂苷，通常在蒺藜皂苷元的C-3和C-26位均连有糖链，其糖链数量差异很大，其代表化合物为甲基原薯蓣皂苷（methylprotodioscin）如图2中A所示。经炮制后双糖链皂苷含有量降低很多，单糖链皂苷 （图2中C所示）、短糖链皂苷 （图2中B所示）及皂苷元 （图2中D所示）的含有量增加，提示双糖链皂苷经炮制可能存在转化过程，过程如图所示，本研究将通过另外实验进一步明确双糖链皂苷转化的过程。

有报道蒺藜的嫩茎鲜品被马、羊等动物食后会引起中毒，但晒干后可作为药物使用，而且经炮制后应用于临床，提示蒺藜经一定方法处理后可能存在 “减毒增效”的作用。结合本实验结果，蒺藜经炮制后总皂苷下降，蒺藜皂苷元TTS的含有量增加，两者是否存在一定联系，是否蒺藜总皂苷是毒性成分，而蒺藜皂苷元是活性成分，其进一步的深入研究具有意义。

图2 蒺藜双糖链皂苷经炮制可能存在转化过程Fig.2 Biglycan saponins of Tribulus terrestris m ay exist transformation p rocess after processing

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Effect of processing on Tribulus terrestris saponins conent

LIRui-hai， FENG Lin， MA Xin-yue， LIU Shu-ping， SUN Yan-jun， JIA Tian-zhu
（College of Pharmacy，Liaoning University of Traditional ChineseMedicine，Dalian 116600，China）

AIMTomeasure the saponins content from Tribulus terrestris before and after the processing and to speculate their processingmechanism of action.METHODSThe analyses of n-butanol part of Tribulus terrestris methanolic extractwere performed on Ultimate LP-C18column（250 mm×4.6 mm，5μm）with methanol water（80∶20）asmobile phase，the detection wavelength was setat203 nm.The perchloric acid was adopted as developer and 25R-spirostan-4-ene-3，12-dione as themarker to determine the Tribulus terrestris saponins content.RESULTS25R-spirostan-4-ene-3，12-dione had good linear relationship in the range of0.82-7.38μg for HPLC and 24.6-86.1μg for colorimetry，their average recoveries were 99.3%and 100.7%，respectively.After stir-baking or stoving，total saponins from Tribulus terrestris decreased，and 25R-spirostan-4-ene-3，12-dione content increased.CONCLUSIONThe experimental data shows that stir-baking or stoving has the same effect on the processing of Tribulus terrestris，theirmechanism of action is related to the change of saponins into structural stable aglycone.

Tribulus terrestris；stir-baking；stoving；25R-spirostan-4-ene-3，12-dione；colorimetry；processing mechanism

R283

：A

：1001-1528（2015）07-1526-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.028

2014-08-06

国家药典委员会，国家药品标准科研项目201203

李瑞海，博士，高级实验师，研究生导师，从事药物制剂方面研究。Tel：（0411）85890183，E-mail：1801517231@qq.com