HPLC-ELSD法同时测定九香虫中的亚油酸、油酸及软脂酸

王新雨， 郑晓媚， 谭晓梅

（南方医科大学中医药学院广东省中药制剂重点实验室，广东广州510515）

HPLC-ELSD法同时测定九香虫中的亚油酸、油酸及软脂酸

王新雨， 郑晓媚， 谭晓梅*

（南方医科大学中医药学院广东省中药制剂重点实验室，广东广州510515）

目的建立一种同时定量测定九香虫中未甲酯化的亚油酸、油酸及软脂酸方法。方法九香虫石油醚提取物以

高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）分析，采用Prevail C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm），乙腈-甲

醇 （95∶5）为流动相进行洗脱，洗脱时间为15 min。结果亚油酸、油酸及软脂酸峰面积的自然对数与相应质量浓

度的自然对数呈良好的线性关系。其中，亚油酸的线性方程为Y=1.211 7X-2.965 6，r=0.999 0，线性范围为

0.135 ～0.450 mg/mL，平均加样回收率为98.1%，RSD为2.5%；油酸的线性方程为Y=1.149 2X-2.757 0，r= 0.999 0，线性范围为0.268～0.893 mg/mL，平均加样回收率为99.6%，RSD为2.3%；软脂酸的线性方程为Y= 1.104 7X-2.327 6，r=0.999 1，线性范围为0.150～0.500mg/mL，平均加样回收率为100.1%，RSD为2.8%。结论该方法中的样品不需要甲酯化，而且测定快速、简便、准确，可作为九香虫饮片的质量控制方法。

HPLC-ELSD；九香虫；亚油酸；油酸；软脂酸

九香虫为蝽科昆虫九香虫（stink-bug，Aspon- gopus chinensis Dallas）的干燥体，具有理气止痛，温中助阳的功效，可用于治疗胃寒胀痛、肝胃气痛、肾虚阳痿、腰膝酸痛［1］。一般认为，九香虫以含油性成分量大者为佳，而粗脂肪占其干质量的53.0%［2］，其中含有油酸、亚油酸及软脂酸等脂肪酸。研究表明［3］，脂肪酸对人体具有平衡调节作用，在降血脂、抗肿瘤、免疫调节等方面起着重要的作用。

目前，对于亚油酸、油酸及软脂酸的测定多采用GC法［4］、GC-MS法［5-6］、柱前皂化或衍生化HPLC法［7-9］、HPLC-ELSD法［10-12］。但GC与GCMS法由于柱温过高，在分析中容易引起亚油酸双键断裂或异构化［13］，并且GC-MS法在质量控制中难以推广；柱前衍生化HPLC法通常是先用石油醚将脂肪酸提出，然后取一定量油脂皂化或衍生化进行测定，操作步骤繁琐，容易造成误差［14-15］；高效液相-蒸发光散射（HPLC-ELSD）法测定脂肪酸时，样品不需要甲酯化，操作简单方便。因此，本实验建立HPLC-ELSD法来测定九香虫中的亚油酸、油酸及软脂酸，为其质量控制和品种评价提供方法。

1 仪器与材料

Agilent1100高效液相色谱仪（美国Agilent Technologies公司）；Alltech 2000蒸发光散射检测器 （美国Alltech公司）。石油醚 （60～90℃）、乙醚、冰醋酸均为分析纯 （国药集团化学试剂有限公司）；甲醇、乙腈均为色谱纯 （德国Merck公司）。亚油酸、油酸、软脂酸 （批号分别为111622-201203、 111621-201004、 190029-201202，中国食品药品检定研究院）。

九香虫饮片 （安徽广印堂中药股份有限公司，批号分别为130801、130901，产地贵州；广州市药材公司中药饮片厂，批号YPA3G0001，产地贵州；广州至信中药饮片有限公司，批号130901，产地贵州；康美药业股份有限公司，批号130813321，产地四川），经南方医科大学中药鉴定教研室刘传明副教授鉴定为蝽科昆虫九香虫Aspongopus chinensis Dallas的干燥体。

2 方法

2.1 色谱条件 Prevail C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为乙腈-甲醇 （95∶5），等度洗脱；体积流量0.8 mL/min；漂移管温度50℃；载气为N2；体积流量1.2 L/min；柱温35℃；进样10μL。色谱图见图1。

2.2 溶液的制备

图1 样品溶液(A)、对照品溶液 (B)和空白溶液(C)的HPLC-ELSD色谱图Fig.1 HPLC-ELSD chromatograms of blank solution(A) reference substances(B)and stink-bug sam p le (C)

2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密称取亚油酸45 mg、油酸89 mg、软脂酸90 mg，分别置于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度。然后，取上述溶液各1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，即得含亚油酸0.45 mg/m L、油酸0.89 mg/mL、软脂酸0.50 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取样品粗粉0.25 g，置于具塞试管中，加入石油醚5 mL，超声20 min，取上清液，重复3次后合并，减压浓缩至无明显醚味，加少许甲醇溶解，转移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 理论塔板数 精密吸取供试品溶液适量，进样10μL，以供试品主成分峰的保留时间 （tR）和半高峰宽 （W/h/2）计算色谱柱的理论塔板数（n），计算公式为n=5.54［tR/（W/h/2）］2。结果，测得亚油酸、油酸、软脂酸理论塔板数分别为9 536、12 527、8 872，分离度均大于1.5。

2.3.2 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液适量，进样10μL，连续6次，计算亚油酸、油酸及软脂酸峰面积。结果，测得三者 RSD分别为1.7%、1.3%、1.6%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验 取供试品溶液适量，分别于0、2、4、8、12、24 h进样10μL，计算亚油酸、油酸及软脂酸峰面积。结果，测得三者RSD分别为1.5%、1.3%、1.8%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液3、4、5、8、9 mL，分别置于10 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，制备每1 mL含亚油酸分别为0.14、0.18、0.23、0.36、0.40 mg，含油酸分别为0.27、0.36、0.45、0.70、0.80 mg，含软脂酸分别为0.15、0.20、0.25、0.40、0.45 mg的溶液，均进样10μL。然后，分别以亚油酸、油酸及软脂酸质量浓度的自然对数为横坐标，峰面积的自然对数为纵坐标，进行线性回归，结果见表1。由表可知，三者在浓度范围内，峰面积自然对数与其质量浓度自然对数均呈良好线性关系。

表1 亚油酸、油酸和软脂酸的线性方程Tab.1 Linear equation of linoleic acid,oleinic acid and palm itic acid

2.3.5 重复性试验 按照 “2.2.2”项下方法，平行制备6份供试品溶液，进样10μL，再采用外标两点法计算亚油酸、油酸及软脂酸的含有量。结果，测得三者RSD分别为1.8%、1.7%和1.7%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验 采用加样回收法，平行制备6份。精密称取九香虫0.125 g，置于试管中，分别加入亚油酸1.45 mg、油酸3.15 mg、软脂酸1.60 mg，再加入石油醚5 mL，超声20 min，取上清液，重复3次后合并，减压浓缩至无明显醚味，少许甲醇溶解，转移至25mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。然后，进样10μL，外标两点法计算三者的含有量和加样回收率，计算公式为加样回收率%=［测得量（mg）-样品中含量（mg）］/对照品加入量×100%，结果见表2、表3和表4。由表可知，三者的平均加样回收率分别为98.1%、99.6%及100.1%，RSD分别为2.5%、2.3%及2.8%，表明该方法回收率良好。

表2 亚油酸加样回收实验结果(n=6)Tab.2 Results of recovery tests for linoleic acid(n=6)

表3 油酸加样回收实验结果(n=6)Tab.3 Results of recovery tests for oleinic acid(n=6)

表4 软脂酸加样回收实验结果(n=6)Tab.4 Results of recovery tests for palm itic(n=6)

2.4 样品测定 取九香虫粗粉5批，分别精密称取0.25 g，按照 “2.2.2”项下方法操作，外标两点法计算样品中亚油酸、油酸及软脂酸的含有量，结果见表5。

表5 样品测定结果(n=3)Tab.5 Determ ination resu lts of sam p les(n=3)

3 结果与讨论

由表5可知，5批样品中亚油酸、油酸、软脂酸的含有量差别较大。在本实验所用的饮片中，批号130813321者为清水炮制，而且其中这3种成分的含有量均高于其他4批盐水炮制的饮片。因此，不同炮制方法是否会影响其有效成分的含有量尚有待于后期进一步研究。

实验发现，流动相乙腈会影响分离效果，当乙腈-甲醇的比例为95∶5时，亚油酸与油酸的分离度大于1.5，且峰形较好。另外，当流动相的体积流量过高时，基线不平稳，而在0.8 m L/min时，基线平稳。而且，漂移管温度和氮气体积流量偏低也能影响基线稳定性，当温度为50℃，体积流量为1.2 L/min时，基线平稳。样品前处理采用正交试验，从提取时间、提取次数以及石油醚加入量的角度进行考查，发现当加入石油醚2 m L、超声20min、提取3次时，亚油酸、油酸及软脂酸的提取效果最好。

本实验采用HPLC-ELSD法测定九香虫中的亚油酸、油酸及软脂酸含有量，不需要甲酯化即可直接分析，避免了甲酯化产物的多样性、甲酯化不彻底等问题，而且操作简便，结果准确可靠。因此，该方法可作为九香虫药材的质量控制方法，也可为其他药材中的这3种成分含有量分析提供参考。

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Simultaneous determ ination of linoleic acid，oleinic acid and palm itic acid in stink-bug by HPLC-ELSD

WANG Xin-yu， ZHENG Xiao-mei， TAN Xiao-mei*
（School of Traditional Chinese Medicine，Southern Medical University；Guangdong Provincal Key Laboratory of Chinese Materia Medica Preparation，Guangzhou 510515，China）

AIMTo establish a method for simultaneous determination of linoleic acid，oleinic acid and palmitic acid content without methyl esterification in stink-bug（Aspongopus chinensis Dallas）.M ETHODSThe high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detection（HPLC-ELSD）method of stink-bug petroleum ether extractwas applied to Prevail C18Column（250 mm×4.6mm，5μm）with acetonitrile andmethanol asmobile phase，and the elution time was15 min.RESULTSThe linear response was calculated by natural logarithm，the linear range of linoleic acid was 0.135～0.450 mg/mL with the regression equation of Y= 1.211 7X-2.965 6，r=0.999 0；the linear range of oleinic acid was 0.268～0.893 mg/mL with the regression equation Y=1.149 2X-2.757 0，r=0.999 0；the linear range of palmitic acid was 0.150～0.500 mg/mL with the regression equation Y=1.104 7X-2.327 6，r=0.999 1.Their average recoverieswere 98.1%，99.6%and 100.1%，and their RSDs were 2.5%，2.3%and 2.8%，respectively.CONCLUSIONThe sample does not need methyl esterification by thismethod，having the advantages of easy operation，accuracy and fast，so it can be used as a quality controlmethod for stink-bug.

HPLC-ELSD；stink-bug（Aspongopus chinensis Dallas）；linoleic acid；oleinic acid；palmitic acid

R284.1

：A

：1001-1528（2015）07-1522-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.027

2014-10-30

王新雨 （1986—），女，博士，研究方向为中药制剂。Tel：13246857938，E-mail：379319742@qq.com

*通信作者：谭晓梅 （1963—），女，博士，研究员，博士生导师，研究方向为中药新制剂。Tel：（020）61648265，E-mail：13710730705@163.com