RP-HPLC法同时测定复方双花口服液中6种活性成分

徐 梅

（三门峡市中心医院药剂科，河南三门峡472000）

RP-HPLC法同时测定复方双花口服液中6种活性成分

徐 梅

（三门峡市中心医院药剂科，河南三门峡472000）

目的建立复方双花口服液中原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、槲皮素、连翘苷和腺苷的定量分析方法。方法采用RP-HPLC法同时测定复方双花口服液中6种活性成分的含有量，Waters symmetry C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm），4%冰醋酸-乙腈梯度洗脱，体积流量为1.0mL/min，柱温30℃，紫外检测波长为300 nm。结果在选定色谱条件下，原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、槲皮素、连翘苷和腺苷在0.079 8～0.478 8μg、0.533 0～3.198μg、0.091 4～0.548 4μg、0.104 0～0.623 7μg、0.138 8～0.802 8μg和0.084 4～0.506 4μg范围内的线性关系良好 （r分别为0.999 0、0.999 0、0.999 3、0.999 5、0.999 4和0.999 9），平均回收率分别为99.6%、99.0%、98.1%、99.0%、98.0%和97.8%，RSD分别为1.2%、2.5%、1.6%、1.2%、1.2%和1.1%（n=9）。结论本方法色谱测定结果显示，各待测物质分离较好 （＞1.5），相互无干扰，重复性好，专属性强，可用于复方双花口服液的质量控制。

复方双花口服液；高效液相色谱法；原儿茶酸；绿原酸；咖啡酸；槲皮素；连翘苷；腺苷

复方双花口服液是由金银花、连翘、穿心莲、板蓝根组成的纯中药口服制剂，临床上常用于清热、解毒，治疗急性扁桃体炎、上呼吸道感染和淋巴结炎等毒热性疾病［1-2］。卫生部标准中采用薄层扫描法对药品中的绿原酸进行了含量测定，方法较繁琐［3］。查阅文献，制剂中多种有效成分同时测定的相关研究较少。本实验采用RP-HPLC法同时测定复方双花口服液中原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、槲皮素、连翘苷和腺苷等6种有效成分的含有量，方法运行时间较短，快速简便，且增加了测定成分，为更全面地评价此口服制剂的质量提供参考。

1 仪器与试药

Waters高效液相色谱仪系统（Waters2695 Separations Module，Waters 2996 Photodiode Array Detector Madein Singapore，美国Waters公司）；KH2200DB型超声波清洗器 （昆山超声仪器）；XS105型电子分析天平（瑞士梅特勒公司）。绿原酸对照品 （批号110753-201314）、原儿茶酸对照品 （批号110809-201205）、槲皮素对照品 （批号100081-201408）、连翘苷对照品 （批号110821-201213）、咖啡酸对照品 （批号 110885-200102）和腺苷对照品 （批号110879-200202）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯，Grace Company INC）；娃哈哈纯净水；醋酸为分析纯。复方双花口服液购自北京海尔富药业有限公司 （批号分别为140406、140504、140505）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters symmetry C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流动相为4%冰醋酸（A）-乙腈 （B），线性梯度洗脱 （0～8 min，9%～19%A；8～15 min，19%～25%A；15～21 min，25%～90%A；31～40 min，90%A），体积流量为1.0 mL/min，紫外检测波长为300 nm，柱温30℃。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密称取原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、槲皮素、连翘苷和腺苷对照品适量，甲醇稀释并定容，制成质量浓度分别为319.2、1 066、365.6、415.8、535.2、337.6μg/mL的单个对照品贮备液。精密量取各对照品贮备液置量瓶中，甲醇稀释并定容，制成混合对照品溶液，质量浓度分别为：原儿茶酸15.96μg/mL，绿原酸106.60μg/mL，咖啡酸18.28μg/mL，槲皮素20.79μg/mL，连翘苷26.76μg/mL和腺苷16.88 μg/mL，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密量取本品1 mL置于10 mL离心管中，加入5 mL甲醇，震荡混合10 min，冰箱静置3 h，3 000 r/min离心20 min，取上清液。沉淀由2 m L甲醇洗涤并离心取上清，重复2次，收集3次上清液于10 mL量瓶，甲醇定容并摇匀。微孔滤膜 （0.22μm）滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按复方双花口服液处方及制剂工艺，制成缺金银花、缺连翘和缺板蓝根的阴性样品，按 “2.2.2”项下供试品溶液的制备方法处理得阴性样品溶液，即得。

2.3 专属性试验 精密吸取混合对照品溶液、阴性供试品溶液及供试品溶液10μL，分别注入高效液相色谱仪，按照 “2.1”项下色谱条件进行检测。记录色谱图，结果显示6种有效成分吸收峰分离良好，对应保留时间处无其他吸收峰，表明阴性无干扰，见图1。

图1 复方双花口服液HPLC色谱图Fig.1 HPLC Chromatograms of Com pound Shuanghua Oral Solution

2.4 线性关系的考察 精密吸取混合对照品溶液5、10、15、20、30μL对照品溶液，按照 “2.1”项下色谱条件，以色谱峰峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线并计算回归方程、相关系数及线性范围。结果表明6种有效成分在检测范围内线性关系良好，见表1。

2.5 稳定性试验 精密吸取新制备的同一供试品溶液 （批号140504），于0、2、4、6、8、10、12进样20μL进行测定，计算RSD值。结果显示，原儿茶酸，绿原酸，咖啡酸，槲皮素，连翘苷和腺苷的含有量分别为146.44、1 114.81、132.17、149.44、192.44、177.05μg/mL，RSD分别为1.1%、0.88%、1.8%、2.8%、2.8%和1.8%，结果表明样品稳定性较好。

表1 标准曲线及线性范围Tab.1 Standard cu rves and linear ranges of active substances

2.6 精密度 取同一批复方双花口服液，按照“2.2.2”项下供试品溶液方法进行制备，重复进样6次进行测定，结果显示原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、槲皮素、连翘苷和腺苷平均含有量分别为143.75、1 109.22、131.34、152.74、190.56、181.82 μg/mL，RSD分别为0.82%、1.3%、1.4%、1.5%、2.0%和2.0%，结果表明精密度良好，符合定量分析要求。

2.7 重复性试验 取同一批复方双花口服液5份，按照 “2.2.2”项下方法制备供试品溶液并进行测定，结果显示原儿茶酸，绿原酸，咖啡酸，槲皮素，连翘苷和腺苷平均含有量分别为 143.46、1 107.53、 129.48、 157.75、 190.94、 184.04 μg/mL，RSD分别为0.85%、1.4%、1.2%、2.7%、1.7%和2.5%。结果表明重复性良好，符合定量分析要求。

2.8 加样回收率试验 精密量取已测得各成分含有量的复方双花口服液样品9份各0.5 mL，按照0.5 mL样品中成分含有量的80%、100%、120%分别精密加入各对照品贮备液，各3份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液并进行测定，计算回收率，结果见表2。

2.9 样品测定 取3批复方双花口服液 （批号分别为140406、140504、140505），每批各3份，按照 “2.2.2”项下方法制备供试品溶液，注入高效液相色谱仪进行测定，结果见表3。

表3 样品测定结果(μg/m L,n=3)Tab.3 Test results of sam p les(μg/m L,n=3)

3 讨论

复方双花口服液由金银花、连翘、板蓝根和陈皮组成，是一种在临床推广已久治疗毒热性疾病的中药制剂。药品生产过程复杂，成分较多，为有效控制其质量稳定性，合理准确的质量控制标准是必须的［4］。

卫生部标准中采用薄层扫描法对药品中的绿原酸进行了定量测定，口服液中的单一有效成分绿原酸或连翘苷的定量测定方法已有相关报道［5-6］，但对制剂中多种有效成分同时测定尚未见到。本实验参考相关文献，采用RP-HPLC法同时测定复方双花口服液中原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、槲皮素、连翘苷和腺苷6种有效成分［7-10］，测量品种较多，运行时间不超过40 min，方法快速简便，比现有文献检测成分多，效率高。

表2 加样回收率试验结果Tab.2 Results of recovery tests

中药制剂成分复杂，杂质较多，本实验在乙腈-4%醋酸流动相系统中进行线性梯度洗脱，色谱测定结果显示，各待测物质分离较好 （＞1.5），相互无干扰［11-13］。原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、槲皮素、连翘苷和腺苷6种有效成分性质不同，紫外条件下有最大吸收波长分别为260 nm、327 nm、323 nm、340 nm、277 nm和260 nm，全波长扫描结果比较显示，在检测波长为300 nm时各成分峰形较好且杂质峰较少［14-16］。在进行供试品处理时，比较了乙腈、甲醇、80%甲醇的3种溶剂系统，结果发现选用甲醇进行处理时，色谱图溶剂峰较小，杂质沉淀完全，回收率试验结果表明回收率均高于95%，表明该处理方法可有效除杂且回收率良好。在相应方法学考察中，仪器精密度良好，重复进样，各有效物质的RSD值均小于3.0%。在稳定性考察中发现，24 h内重复进样，各有效成分含有量变化较小，测定重复性好，表明本方法稳定准确。

综上所述，本实验采用RP-HPLC法同时测定复方双花口服液中6种有效成分的含有量并进行了相应的方法学考察，结果显示方法灵敏简便，重复性好，且有较高的准确性，可为复方双花口服液质量控制标准提供参考依据。

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［2］邓燕飞.复方双花口服液治疗急性扁桃体炎97例临床分析［J］.中成药，1999，13（5）：29-30.

［3］WS3-366（Z-52）-97（Z），中华人民共和国卫生部标准［S］.

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［14］李 晋，王春鹏，马 琳，等.高效液相色谱法同时测定中药连翘药用及非药用部位中7种有效成分含量［J］.天津中医药，2014，11（7）：440-443.

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Determ ination of six constituents in Compound Shuanghua Oral Solution by RPHPLC

XU Mei
（Sanmenxia Central Hospital，Sanmenxia 472000，China）

AIMTo establish a fast and sensitivemethod for simultaneously determining six constituents，including protocatechuic acid，chlorogenic acid，caffeic acid，meletin，phillyrin and adenosine in Compound Shuanghua Oral Solution.METHODSRP-HPLC analysis of six active constituents was performed on Waters symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5μm）column in a gradient elution manner with 4%acetic-acid-acetonitrile asmobile phase.The flow ratewas1.0 mL/min.The column temperature wasmaintained at30℃.And the detection wavelength was set at300 nm.RESULTSThe linear relationship of the six active constituentswerewithin the range of 0.0798-0.478 8μg，0.533 0-3.198μg，0.091 4-0.548 4μg，0.104 0-0.623 7μg，0.138 8-0.802 8 μg，and 0.084 4-0.506 4μg，with r were 0.999 0，0.999 0，0.999 3，0.999 5，0.999 4 and 0.999 9，respectively.The average recoveries were 99.6%（RSD=1.2%），99.0%（RSD=2.5%），98.1%（RSD= 1.6%），98.9%（RSD=1.2%），98.0%（RSD=1.2%），and 97.8%（RSD=1.1%），respectively.CONCLUSIONThemethod is feasible，precise and reproducible.It can be used for the quality control ofCompound Shuanghua Oral Solution.

Compound Shuanghua Oral Solution；HPLC；protocatechuic acid；chlorogenic acid；caffeic acid；meletin；phillyrin；adenosine

R927.2

：A

：1001-1528（2015）07-1482-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.019

2014-11-19

徐 梅（1973—），女，主管药师，从事医院药学研究。Tel：13273988116，E-mail：meixu186@126.com