基于自由基学说研究决明子水煎液对小鼠静止代谢率和抗氧化活性的影响

2015-01-16吴宿慧刘亚敏李寒冰李根林

中成药 2015年6期

关键词：水煎液代谢率决明子

吴宿慧，刘亚敏，李寒冰，李根林

（河南中医学院，河南郑州450046）

基于自由基学说研究决明子水煎液对小鼠静止代谢率和抗氧化活性的影响

吴宿慧，刘亚敏，李寒冰，李根林*

（河南中医学院，河南郑州450046）

目的在自由基学说的指导下，研究决明子水煎液对小鼠静止代谢率和抗氧化活性的影响，为决明子轻身延年的作用机制提供理论和实验依据。方法制备决明子水煎液质量浓度为1 g（生药质量）/mL，50只SPF级ICR小鼠随机分为5组，即空白对照组，决明子高（20 mg/kg）、中（10 mg/kg）、低（5 mg/kg）剂量组，维生素E（VE）组（阳性对照，5 mg/kg），每组10只，自由饮水和取食。每天上午9点测体质量、灌胃给药，连续给药28 d，每天1次，给药体积为20mL/kg。实验结束前一天测定动物静止代谢率（RMR），当晚20点禁食，第2天早上处死动物，取血清，ELISA方法测定SOD、GSH-Px和MDA及胰脂肪酶、脂联素等指标。结果与空白对照组相比，随着决明子剂量增大，小鼠体质量、胃肠湿重和胃肠指数与静止代谢率等整体指标均有显著性降低，并与剂量呈现明显量效关系，不同给药组的GSH-Px浓度、SOD酶活力均无显著变化，P＞0.05，而MDA在决明子高剂量组和中剂量组有显著降低，P＜0.05。决明子高剂量组和中剂量组的胰脂肪酶活力有显著降低，P＜0.05。各给药组脂联素水平无显著性差异。相关分析结果表明：血清中GSH-Px水平与静止代谢率（RMR）之间无显著性相关关系（R=-0.217，P＞0.05）；SOD活力与RMR之间有极显著的负相关关系（R=-0.580，P＜0.001）；MDA浓度与RMR之间有极显著的正相关关系（R=0.421，P＜0.05）。结论该结果符合预测，支持假说，也表明了自由基学说在小鼠静止代谢率和衰老研究中的桥梁作用。该实验为探究决明子抗衰老的药理作用机制提供了理论和实验依据，亦为指导其临床合理应用提供了强有力的证据。

决明子；小鼠；抗衰老；静止代谢率；抗氧化作用

衰老是多因素导致的身体机能的下降，同时伴随着生化和生理功能的减弱，因此对外界环境、压力、挑战等反应会有所降低，更易患上年龄相关的疾病而死亡［1］。在对衰老现象的探索中，衰老形成的原因与能量支出之间联系已经有近2个世纪的研究历史了［2］，若个体能量支出增加，则可能导致寿命减少。Pearl把这种现象成为“rate-of-living”，认为生物体的寿命是固定的，如果动物浪费过多精力，寿命则减少；如果节约降低生活成本，则寿命延长［3］。自由基学说把衰老研究和代谢联系起来，并认为呼吸代谢氧化磷酸化过程中产生过多的自由基对生物体大分子物质的氧化损伤会加速衰老的进程［4］。在对体内自由基的清除作用进行研究时，超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）及丙二醛（MDA）是一贯的焦点。且在衰老过程中，如何降低高血脂，预防肥胖、糖尿病等疾病的发生也受到了广泛的关注。

决明子Cassiae Semen为豆科植物决明Cassia obtusifolia L.或小决明Cassia tora L.的干燥成熟种子，是国家卫生部公布的69种药食同源品种之一，性味甘、苦、咸、微寒。归肝、大肠经。本草记载具有 “轻身”作用，现代药理研究具有清热明目，润肠通便之功效，常作各种保健用途［5］。古人有诗云：愚翁八十目不膜，日书蝇头夜点星，并非生得好眼力，只缘常年服决明。中医养生理论认为可以从食补、药补以及采取自我调摄等为主的综合措施以达到延缓衰老、延年益寿的目的。课题组在前期研究中，基于自由基学说，通过直接观察决明子水煎液对家蚕寿命的影响及机制探讨发现：决明子水煎液能延长家蚕寿命，降低氧耗，并且体内SOD等抗氧化物质活性有所增强，同时发现决明子润肠通便之功效影响到机体对能量的摄取与支出，这可能是决明子发挥作用的主要途径之一。为了进一步研究决明子抗衰老作用及其机制，课题组又开展了一系列以小鼠为研究对象的实验，测定了以静止代谢率（RMR）为代表的能量支出，以SOD、GSH-Px和MDA为代表的抗氧化指标，及以胰脂肪酶和脂联素为代表的调血脂指标，以期为决明子新的药用开发提供参考和依据。可以预测：若决明子抗衰老作用符合自由基学说，那么与之相联系的抗氧化指标如SOD、GSH-Px及MDA则会有不同程度的活性变化，能量支出降低。

1 实验材料与方法

1.1 实验药物决明子购自郑州市本草国药馆，经河南中医学院中药资源鉴定教研室陈随清教授鉴定为豆科植物决明Cassia obtusifolia L.的干燥成熟种子，为《中国药典》2010年版收载的正品；维生素E由青岛双鲸药业有限公司生产（国药准字H20043134，批号001008）。

1.2 实验动物 ICR小鼠，SPF级，体质量18～22 g之间，由河南省实验动物中心提供，其许可证号SCXK（豫）2010-0002，动物合格证号：0008433。动物饲养室环境温度控制在（25±2）℃，光周期为12L∶12D，整个实验过程中，动物自由饮水和取食。

1.3 试剂与仪器超氧化物歧化酶（SOD）ELISA试剂盒（批号20121105）、丙二醛（MDA）ELISA试剂盒（批号20121108）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）ELISA试剂盒（批号20121101）、胰脂肪酶 ELISA试剂盒（批号20121112）、脂联素ELISA试剂盒（批号20121115），以上试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

BIORAD-680酶标仪（Bio-Rad Laboratories）；DZKW-4电子水浴锅（上海东星建材试验设备有限公司；BS-210S电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；SZ-093双重蒸馏器（上海市亚荣生化仪器厂）；TDL-40B型低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。

2 实验方法

2.1 决明子水煎液的配置称取决明子100.0 g，常温下加10倍量双蒸水煎煮1 h，过滤，药渣加800mL水再次煎煮1 h，合并两次滤液，浓缩至100 mL。每1 mL含生药质量1 g，放置冰箱中（0～4℃）保存备用。用时稀释成相应浓度。

2.2 实验分组 50只ICR小鼠随机分为5组，雌雄各半，分开饲养。分别为空白对照组，决明子水煎液高、中、低剂量组，阳药对照组。每天上午9点灌胃给药，连续给药28 d，每天1次，给药体积为20 mL/kg。高剂量组给药剂量为20 mg/kg；中剂量组给药剂量为10 mg/kg；低剂量组给药剂量为5 mg/kg；阳性对照药维生素E组给药剂量为5 mg/kg；空白组给相同体积的蒸馏水。每天称取动物体质量，按照体质量给药。

2.3 呼吸代谢测定实验结束前一天给药后，用CYES-H型O2、CO2气体测定仪（上海精胜科学仪器有限公司）测定动物RMR，测定前，将仪器放在新鲜空气环境中（室温20～25℃，湿度70%），在进气口接一根长约20 cm的硅胶管，另一端和被测气体相连。以空气中氧浓度21.0%定标，待读数稳定后，再定CO2浓度。之后，把小鼠放入一个容积为2 L的密闭容器里，用KOH和干燥硅胶吸收呼吸室内的CO2和水分，放置在30℃ （小鼠的热中性区温度）恒温箱内1 h，待动物稳定后，开始记录耗氧量，每隔5 min记录1次，连续测定1 h。选取2个连续稳定的最低值来计算RMR。代谢率（耗氧量）值均校对为标准状态（0℃，1个大气压）下。每次完成读数后，用新鲜空气清洗气路，重新定标调零。重复3次。以耗氧量（mL·g-1·h-1）表示其代谢速率。

2.4 血清中各指标测定末次给药后1 h，摘眼球取血，为了减少食物对各指标的影响，处死前一天晚上20点开始禁食12 h。血液4 000 r/min离心，取血清，血清中超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛（MDA）水平、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力及胰脂肪酶与脂联素水平均根据ELISA试剂盒所附方法及步骤进行测定。

2.5 数据处理所得数据运用独立样本T检验性别差异，各组均P＞0.05，故做为整体一起统计。

结果用x±s表示。数据分析用SPSS 17.0统计软件，组间比较采用单因素方差分析（one way ANOVA），多重比较采用Turkey HSD方法进行分析。

3 实验结果

3.1 体质量、胃肠湿质量和胃肠指数单因素方差分析结果表明：体质量在不同处理组间虽然有下降的趋势，但统计上无显著性差异（F4，36=0.634，P＞0.05，one-way ANOVA）。胃肠湿质量在各处理组间有显著性差异（F4，36=5.795，P＜0.01，one-way ANOVA）。胃肠指数在各处理组间亦有显著性差异（F4，36=14.480，P＜0.001，one-way ANOVA）。

多重比较（Turkey HSD）结果表明：体质量无论与空白组比较，还是与阳性对照药（VE）组比较，各组间均无显著性差异。胃肠湿质量与空白对照组相比时，决明子水煎液高剂量组和中剂量组均有显著性差异，显著性水平均为P＜0.01，决明子水煎液低剂量组未见显著性差异；与阳性药组比较时均无显著性差异。胃肠指数与空白对照组比较时，决明子水煎液高剂量组和中剂量组均有显著性差异，显著性水平均为P＜0.001，决明子水煎液低剂量组未见显著性差异；与阳性药组比较时仅决明子水煎液高剂量组有显著性差异，P＜0.05。见表1。

3.2 静止代谢率（RMR）单因素方差分析结果表明：不同组间的静止代谢率有显著性差异（F4，36=3.783，P＜0.05，one-way ANOVA）。多重比较（Turkey HSD）结果表明：若与空白对照组相比，决明子高剂量组与中剂量组静止代谢率有显著降低，显著性水平均为P＜0.05，决明子低剂量组无显著差异。若与阳性对照药相比，3个给药组则均无显著性差异，P＞0.05。见表2。

表1 不同剂量决明子水煎液对小鼠体质量、胃肠湿质量、胃肠指数的影响（x±s，n=10）

表2 不同剂量决明子水煎液对小鼠静止代谢率（RM R）的影响（x±s，n=10）

3.3 对血清中GSH-Px、SOD、MDA的影响单因素方差分析结果表明：不同组间的GSH-Px质量浓度无显著性差异（F4，35=0.693，P＞0.05，one-way ANOVA）。不同组间的SOD酶活力有显著性差异（F4，36=2.801，P＜0.05，one-way ANOVA）。不同组间的MDA浓度有极显著性差异（F4，36=4.098，P＜0.01，one-way ANOVA）。

多重比较（Turkey HSD）结果表明：若与空白对照组相比，不同给药组的GSH-Px质量浓度、SOD酶，活力均无显著变化，P＞0.05，而MDA在决明子高剂量组和中剂量组有显著降低，P＜0.05，P＜0.05。与阳性对照药组相比，不同给药组的GSH-Px水平、SOD酶活、MDA水平均无显著变化，P＞0.05。见表3。

表3 不同剂量决明子水煎液对小鼠血清中GSH-Px、SOD、MDA的影响（x±s，n=10）

3.4 对血清中胰脂肪酶、脂联素的影响单因素方差分析结果表明：各组间的胰脂肪酶活力有显著性差异（F4，36= 3.329，P＜0.05，one-way ANOVA）。不同组间的脂联素水平无显著差异（F4，36=0.767，P＞0.05，one-way ANOVA）。

多重比较（Turkey HSD）结果表明：若与空白对照组相比，决明子高剂量组和中剂量组的胰脂肪酶活力有显著降低，P＜0.05。各给药组脂联素水平无显著性差异。与阳性对照药组相比，不同给药组的胰脂肪酶活力、脂联素水平均无显著变化，P＞0.05。见表4。

表4 不同剂量决明子水煎液对小鼠血清中胰脂肪酶、脂联素的影响（x±s，n=10）

3.5 RMR与血清中GSH-Px、SOD、MDA的相关分析皮尔逊相关（Pearson correlation）分析结果表明：血清中GSH-Px质量浓度与静止代谢率（RMR）之间无显著性相关关系（R=-0.217，P＞0.05），见图1；血清中SOD活力与静止代谢率（RMR）之间有极显著的负相关关系（R=-0.580，P＜0.001），见图2；血清中MDA浓度与静止代谢率（RMR）之间有显著的正相关关系（R=0.421，P＜0.05），见图3。

图1 血清中GSH-px浓度与静止代谢率（RM R）之间的相关关系

图2 血清中SOD酶活力与静止代谢率（RMR）之间的相关关系

4 讨论

图3 血清中M DA浓度与静止代谢率（RMR）之间的相关关系

实验中能量支出与寿命的关系比较复杂。很多物种中，静止代谢率（RMR）和基础代谢率（BMR）可能与寿命有关系［6-7］。文献报道实验手段增加小鼠［8］及大鼠［9］、田鼠［10］的能量支出，RMR增加，却没有增加其寿命。也有报道：适当运动致能量支出增加，小鼠寿命则有延长［11］。无脊椎动物实验结果则更多倾向于：能量支出减少，寿命延长。例如：低温或巢穴减小造成的家蝇（Musca domestica）和果蝇（Drosophila.）活动减少能增加寿命［12-13］。乌龟亦是如此。目前，后者公认度更为广泛。研究证实，限制热量摄入，代谢率降低，是广泛适用于各类动物种属的抗衰老方法。

本实验中，随着决明子剂量增大，小鼠体质量、胃肠湿质量和胃肠指数与静止代谢率等整体指标均有显著性降低，并与剂量呈现明显量效关系，这与决明子的润肠通便之功效相符，表明机体可能通过胃肠内容物减少，体质量降低。根据能量平衡原理，摄入的能量若有减少，则供机体支出的能量也会减少，故静止代谢率会降低。

自由基学说相联系的指标，MDA是膜脂过氧化终产物，衰老时，活性氧积累诱发膜脂过氧化加快，MDA增多。SOD作为生物体内的 “垃圾清道夫”，可清除机体内的超氧阴离子自由基。GSH-Px作为机体中重要的过氧化物分解酶，对保护细胞膜的结构和功能不受过氧化物的干扰和损害。在决明子水煎液的作用下，若与空白对照组相比，血清中MDA在高剂量组和中剂量组有极显著地降低，SOD和GSH-Px则略有升高，但无显著统计学意义；与维生素E组相比，均无显著差异。符合预测，支持假说。

自由基学说把衰老研究与能量代谢联系起来，本实验对抗氧化指标和静止代谢率进行相关分析，结果表明：血清中GSH-Px水平与静止代谢率（RMR）之间无显著性相关关系（R=-0.217，P＞0.05）：SOD活力与静止代谢率（RMR）之间有极显著的负相关关系（R=-0.580，P＜0.001）；MDA浓度与静止代谢率（RMR）之间有极显著的正相关关系（R=0.421，P＜0.05），可推测：SOD增多，MDA减少，则RMR降低，寿命得到延长。由此可知，自由基学说在小鼠静止代谢率和衰老研究中起到了纽带作用。

在体内，脂肪酸的氧化过程有大量氧化中间产物生成，且过多的脂肪会引起肥胖、糖尿病等一系列代谢综合征，加速衰老进程。在对代谢综合征的研究中发现，人体对食物脂肪的摄入是直接或间接的诱因，控制食物脂肪的摄入，可有效地控制高脂血症的出现，并可预防肥胖、糖尿病等疾病的发生。胰脂肪酶水解膳食脂肪，可调节机体的血脂水平。脂联素是脂肪细胞分泌的一种胰岛素增敏激素，可调节机内的血糖水平。在决明子水煎液的作用下，与空白对照组相比，高剂量组和中剂量组血清中胰脂肪酶水平有显著降低，脂联素水平略有升高，但无显著差异。该结果表明决明子降脂作用与胰脂肪酶活性抑制有关，与研究组前期体外结果一致［14］，可能是决明子作为传统 “轻身”药、现代减肥药的基础［15］。

《神农本草经》将决明子列为上品，谓其"主青盲、目淫、肤赤、白膜、眼赤通、泪。服益精光，轻身"。而中医中的轻身是指机体处于健康状态，如 “轻身延年”［15-16］。现代药理学研究表明中药有效成分可与体内自由基结合，抑制过氧化反应，降低脂褐素和增龄色素的沉积，延缓衰老［15］。本实验中，不同剂量的决明子水煎液使小鼠体内的抗氧化指标SOD、GSH-Px活力有一定升高、MDA浓度有显著降低，我们推测，这一结果与决明子的功效息息相关：其具有的润肠通便之功效可以排出随年龄增长而在体内积累的毒素，另外决明子的抗氧化作用可清除糖、脂肪、蛋白质代谢过程中产生的自由基，避免大分子物质交联，使机体氧化应激能力增强，改善衰老状态。符合预测，支持了自由基学说。该研究结果对于探究决明子的药理作用机制提供了理论和实验依据，也为指导其临床合理应用提供了强有力的证据。

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R285.5

：B

：1001-1528（2015）06-1343-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.042

2014-02-28

河南中医学院博士科研基金（BSJJ2009-37）；金水区技术研究与开发经费支持项目（金科［2011］31号项目序号：45）；河南省教育厅科学技术重点资助项目（14A310023）

吴宿慧，博士，讲师，主要从事药理学和中药药理学研究。E-mail：iwusuhui@163.com

*通信作者：李根林，教授，主要从事中药抗衰老作用研究。E-mail：lhb8899@163.com

日期：2014-12-16