柿叶乙酸乙酯部位急性毒性及其对S180荷瘤小鼠的影响

2015-01-16梁宇红马新博

中成药 2015年6期

关键词：柿叶荷瘤环磷酰胺

陈丽，罗宇，梁宇红，马新博，韦敏，陈君*

（1.广西科技大学医学院，广西柳州545005；2.柳州市工人医院，广西柳州545005；3.柳州市人民医院，广西柳州545006）

柿叶乙酸乙酯部位急性毒性及其对S180荷瘤小鼠的影响

陈丽1，罗宇1，梁宇红2，马新博1，韦敏3，陈君1*

（1.广西科技大学医学院，广西柳州545005；2.柳州市工人医院，广西柳州545005；3.柳州市人民医院，广西柳州545006）

目的研究柿叶乙酸乙酯部位对正常小鼠急性毒性试验和对S180荷瘤小鼠的影响。方法在急性毒性试验的基础上，建立S180荷瘤小鼠模型。将荷瘤小鼠随机分为柿叶乙酸乙酯部位高、中、低剂量组，模型组和环磷酰胺组。给药10 d后观察小鼠的肿瘤生长情况，计算抑瘤率、生命延长率、胸腺系数、脾脏系数、肝脏系数，瘤组织做病理切片。结果小鼠一次灌胃柿叶乙酸乙酯部位最大给药量不小于生药589.82 g/kg。环磷酰胺及柿叶乙酸乙酯部位高、中、低剂量对S180荷瘤小鼠抑瘤率分别为73.47%、37.91%、27.22%、11.02%。生命延长率分别为54.91%、36.99%、22.54%、8.09%。柿叶乙酸乙酯部位高、中、低剂量组的胸腺系数［（2.91±0.38）mg/g、（2.82±0.31）mg/g、（2.64±0.20）mg/g］和脾脏系数［（8.49±0.36）mg/g、（8.11±0.48）mg/g、（8.03±0.42）mg/g］均明显比模型组［（2.20±0.36）mg/g、（7.42±0.92）mg/g］和环磷酰胺组［（1.94±0.24）mg/g、（6.81±0.52）mg/g］高（P＜0.01）。柿叶乙酸乙酯部位高、中、低剂量组的肝脏系数［（49.24±6.33）mg/g、（51.17±4.88）mg/g、（55.59±8.74）mg/g］比模型组（62.19±8.10）mg/g和环磷酰胺组（69.19±9.50）mg/g低（P＜0.01或P＜0.05）。用药组肿瘤组织HE染色后，均可见不同程度的坏死灶，其中柿叶乙酸乙酯部位高剂量组坏死面积最大。结论柿叶乙酸乙酯部位毒性低，能抑制S180荷瘤小鼠肿瘤增殖。

柿叶；乙酸乙酯部位；肉瘤S180小鼠；抗肿瘤作用；急性毒性

柿叶为柿树科Ebenaceae柿树属Diospyros植物柿Diospyros kaki L.f.的新鲜或干燥叶。柿叶具有抗菌消炎、生津止渴、清热解毒、润肺强心、镇咳止血、抗癌防癌等多种医疗保健功能。已有报道，柿叶水、醇提取物作用于体外H22细胞和H22、S180荷瘤小鼠，有明显的抑瘤效应［1-3］；柿叶黄酮能明显抑制由TNF-α诱导的大鼠血管平滑肌细胞凋亡信号调节激酶1蛋白的表达［4］，并对人肝癌SMMC-7721细胞的形态有一定的诱变作用及一定的抑制增殖作用［5］。柿叶主要有效成分黄酮类化合物存在于其乙酸乙酯部位，故本研究以S180荷瘤小鼠为研究对象，对柿叶乙酸乙酯部位体内抗肿瘤作用进行初步研究，为进一步开发利用柿叶提供一定的实验依据。

1 材料

1.1 药品与试剂柿叶（购自广西柳州市城站药材综合市场，经中国科学院广西植物研究所韦发南研究员鉴定为真品）；柿叶乙酸乙酯部位由实验室自行制备：柿叶粗粉500 g用70%乙醇回流提取2次，合并滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩后用乙酸乙酯萃取3次，萃取液减压浓缩干燥，研碎得乙酸乙酯萃取部位13.75 g，用时以吐温80为增溶剂，加蒸馏水适量即得不同质量浓度的受试物，现用现配；空白溶剂：由0.5 mL吐温80与50 mL蒸馏水混匀即得；环磷酰胺（陕西普德药业股份有限公司，批号：04120703）。

1.2 仪器 RE-52旋转式蒸发器（上海安亭实验仪器有限公司）；BSC-1300ⅡA2生物安全柜（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；TS-12F生物组织自动脱水机（孝感市电子仪器厂）；NP-B型生物组织包埋机（孝感市诺普电子科技有限公司）；RM2235组织切片机（德国徕卡）；NP-P型生物组织摊片烤片机（孝感市诺普电子科技有限公司）；BX-53显微镜（日本Olympus公司）；SB-3200DTDN超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；移液器（赛默飞世尔仪器有限公司）。

1.3 动物健康昆明种小鼠120只，雌雄各半，体质量18～22 g，由广西医科大学实验动物中心提供（许可证号：SCXK桂2009-0002）；S180肉瘤荷瘤小鼠购自广西中医药研究院。

2 方法

2.1 急性毒性试验［6］健康昆明小鼠20只，雌雄各半，随机分成对照组和给药组，每组10只，试验前禁食不禁水12 h。对照组给予空白溶剂。给药组给予柿叶乙酸乙酯部位，以吐温80为增溶剂，加适量蒸馏水研磨均匀，配制成刚好能通过16号灌胃针的混悬液，按小鼠灌胃最大容积一次给药（灌胃容积为0.4 mL/10 g），即16.22 g/kg，相当于生药589.82 g/kg。给药后立即观察小鼠的反应，包括行为活动、大小便、体质量及死亡情况，连续观察14 d。试验结束第15天颈椎脱臼处死小鼠，解剖观察其心、肝、脾、胃、肾等主要器官的变化。

2.2 柿叶乙酸乙酯部位对S180荷瘤小鼠的影响 S180腹水小鼠连续传代，将接种第7天腹水饱满的S180荷瘤小鼠以颈椎脱臼法处死，无菌条件下抽取其乳白色腹水，加入生理盐水使瘤细胞稀释至1×107个/m L，然后于小鼠右前肢腋窝皮下注射0.2mL/只，接种100只。接种次日，随机将小鼠分为5组，每组20只，雌雄各半，分别为：模型组、环磷酰胺组、柿叶乙酸乙酯部位高、中、低剂量组。接种次日给药，各组用药情况为：模型组灌胃空白溶剂20mL/kg；环磷酰胺组灌胃环磷酰胺100mg/kg；柿叶乙酸乙酯部位按2、1、0.5 g/kg剂量以等体积（0.2 mL）不同浓度灌胃（分别相当于生药72.73 g/kg、36.36 g/kg、18.18 g/kg）；各组每天用药1次，连续10 d，实验期间每天定量喂饲，次日称取剩余饲料，计算小鼠每日摄食量，实验前和实验结束后称量小鼠体质量。第11天各组以颈椎脱臼法随机处死10只小鼠，雌雄各半，剩余小鼠亦停药并记录存活天数用以计算生命延长率，存活天数超过30 d的按30 d计［7］。处死的小鼠小心剥离瘤组织、胸腺、肝脏、脾脏，称重，并计算抑瘤率、胸腺系数、脾脏系数和肝脏系数。将剥离的肿瘤组织HE染色，光学显微镜观察肿瘤组织病理变化并采集图片。各计算公式为：

表示，组间比较用单因素方差分析，P＜0.05或P＜0.01差异显著，有统计学意义。

3 结果

3.1 急性毒性试验按小鼠灌胃最大容积给药后，部分小鼠有恶心、少动现象，约0.5 h后恢复正常。连续观察14 d，对照组和给药组小鼠行为活动、大小便都正常，无小鼠死亡。每7天称一次体质量，体质量均正常增加，两组无显著性差异，结果见表1。第15天处死给药组小鼠后取其心、肝、脾、胃、肾用肉眼与对照组进行比较，未见组织有异常改变。因此，可认为柿叶乙酸乙酯部位毒性低，小鼠一次灌胃柿叶乙酸乙酯部位的最大给药量不小于生药589.82 g/kg。

表1 柿叶乙酸乙酯部位对正常小鼠体质量的影响（n= 10，x±s）

3.2 柿叶乙酸乙酯部位对S180荷瘤小鼠体质量和摄食量的影响从表2可见，给药期间，环磷酰胺组小鼠平均摄食量明显比其他组少，柿叶乙酸乙酯部位各剂量组摄食量明显高于环磷酰胺组和模型组（P＜0.05或P＜0.01）；给药前各组小鼠体质量无显著性差异，给药10 d后柿叶乙酸乙酯部位各剂量组小鼠体质量均比模型组和环磷酰胺组显著增加（P＜0.01），模型组与环磷酰胺组的体质量无显著性差异。

表2 给药期间S180荷瘤小鼠的摄食量和体质量的影响（x±s，n=20）

3.3 柿叶乙酸乙酯部位对S180荷瘤小鼠瘤质量、抑瘤率、胸腺系数、脾脏系数和肝脏系数的影响从表3可见，柿叶乙酸乙酯部位各剂量组均有不同程度的抑瘤效果，其中乙酸乙酯高剂量组效果更为明显，但低剂量组的瘤质量和模型组无显著性差异（P＞0.05），从数据上看，柿叶乙酸乙酯部位对S180小鼠的抑瘤率与剂量具有一定的正相关性；柿叶乙酸乙酯高、中、低剂量组胸腺系数、脾脏系数、肝脏系数与环磷酰胺组相比较，区别明显（P＜0.05或P＜0.01），但与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），说明环磷酰胺对胸腺、脾脏、肝脏的毒副作用明显，而柿叶乙酸乙酯部位对以上脏器无损害。

表3 柿叶乙酸乙酯部位对S180小鼠抑瘤率、胸腺指数、脾脏指数和肝脏指数的影响（x±s，n=10）

3.4 柿叶乙酸乙酯部位对S180荷瘤小鼠生命延长率的影响

柿叶乙酸乙酯高、中、低剂量组的荷瘤小鼠生存天数与模型组比较明显延长（P＜0.01），柿叶乙酸乙酯低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），柿叶乙酸乙酯部位对S180小鼠的生命延长率与剂量有一定的正相关，结果见表4。

表4 柿叶乙酸乙酯部位对 S180小鼠生命延长率的影响（x±s，n=10）

3.5 肿瘤组织病理学观察 HE染色可见模型组肿瘤组织排列不规则，肿瘤细胞较大，核浆比例大，异型性明显，可观察到巨核、双核、奇异核等肿瘤细胞，病理性核分裂象较多；环磷酰胺组亦可见少量模型组肿瘤细胞的形态特征，有少量纤维化组织形成，肿瘤组织中可见大片坏死灶，病理性核分裂象很少；柿叶乙酸乙酯部位各剂量组中，高剂量组肿瘤组织中可见明显片状的凝固性坏死，坏死面积明显比中、低剂量组大，可呈一定量效关系，瘤细胞核固缩，大小较为一致，异型性小，坏死主要位于排列松散的细胞间，病理性核分裂象比模型组明显减少。见图1。

4 讨论

陈壁峰等［8］将柿叶乙醇提取物用于大鼠，发现有亚慢性毒性和致畸作用；吴睿等［9］对柿叶提取物进行急性毒性及其遗传毒性研究，结果未见明显毒性。由柿叶乙酸乙酯部位开发而成的 “脑心清片”等中成药已应用于临床多年［10］，但柿叶乙酸乙酯部位的急性毒性却鲜有报道。本研究采用经典的最大给药量试验对柿叶乙酸乙酯部位进行急毒试验，给药后观察14 d，结果无动物死亡，未能测定出LD50，小鼠体质量均正常增加，与对照组无显著差异；试验结束时观其心、肝、脾、胃、肾，未见病理改变。故可认为柿叶乙酸乙酯部位毒性低，小鼠一次灌胃柿叶乙酸乙酯部位的最大给药量不小于生药589.82 g/kg，验证了前述报道。

图1 给药10 d后各组小鼠肿瘤组织病理切片（×200）

通过提高机体的免疫功能而控制肿瘤的生长、发展已渐渐成为恶性肿瘤治疗的手段之一，中药对机体的免疫调节和扶正抗癌作用已越来越受到人们的重视［11］。环磷酰胺虽有很高的抑瘤作用（抑瘤率高达73.47%），但其所导致的食欲降低［12］及对免疫器官、代谢器官的影响在不少文献中有报道［13-14］，本研究亦验证了环磷酰胺在这方面的毒副作用。实验中荷瘤小鼠应用环磷酰胺后平均摄食量减少，体质量增加不多，并且胸腺和脾脏的质量减少，肝脏质量增加，说明环磷酰胺可导致小鼠食欲下降，减少S180荷瘤小鼠免疫器官胸腺和脾脏的质量，增加代谢器官肝脏的质量，对免疫器官和代谢器官有一定的毒性。柿叶乙酸乙酯部位不影响小鼠的摄食量和体质量，并能增加S180荷瘤小鼠胸腺和脾脏的质量，减少代谢器官肝脏的质量，从而提高胸腺系数、脾脏系数，降低肝脏系数，说明柿叶乙酸乙酯部位对S180荷瘤小鼠的免疫和代谢器官具有一定的保护作用，但其对S180荷瘤小鼠的免疫效应需做进一步研究。另外，环磷酰胺需临用临配，因为该药配成溶液后不稳定，应于2～3 h内输入体内。

生命延长率和抑瘤率是抗肿瘤药物在药效学研究方面的重要和基础性指标，一种药物是否能够抗肿瘤首先表现在这两个方面［15］。本研究表明柿叶乙酸乙酯部位对S180荷瘤小鼠最长生命延长率为36.99%，可明显延长荷瘤小鼠的生存时间；柿叶乙酸乙酯部位能显著减少S180荷瘤小鼠的瘤质量，提高抑瘤率，最大抑瘤率为37.91%。以上研究结果说明柿叶乙酸乙酯部位对S180荷瘤小鼠具有明显的抗肿瘤作用，并且该部位对S180荷瘤小鼠的生命延长率和抑瘤率与剂量具有一定的正相关性，其量效关系及进一步的机制有待深入研究。

肿瘤组织病理学切片可见，模型组肿瘤组织内坏死细胞较少，肿瘤细胞排列紊乱，核染色深，异形核细胞多见。用药后肿瘤组织内可见大面积坏死细胞，可见纤维化的形成。这从微观病理学角度说明柿叶乙酸乙酯部位能促进肿瘤细胞的死亡，抑制S180荷瘤小鼠肿瘤细胞的生长。柿叶乙酸乙酯部位是否确实能诱导肿瘤细胞早期凋亡，需对瘤组织进行超微结构的观察。

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