双辅料炮制对盐附子传统性状和酯型生物碱的影响

国 伟， 谭 鹏， 吴月娇， 秦语欣， 赵玲玲， 李 飞

（北京中医药大学，北京100102）

双辅料炮制对盐附子传统性状和酯型生物碱的影响

国 伟， 谭 鹏， 吴月娇， 秦语欣， 赵玲玲， 李 飞*

（北京中医药大学，北京100102）

目的研究甘草、黑豆炮制对盐附子外观性状和化学成分的影响。方法按 《中国药典》中方法制备淡附片、甘草制及黑豆制对照饮片，采用HPLC法测定3种双酯型生物碱总量和3种单酯型生物碱总量，采用HPLC-MS分析成分组成。结果与盐附子比较，淡附片、甘草和黑豆制两种对照饮片中所含3种双酯型生物碱总量均降低97%以上，淡附片中3种单酯型生物碱总量增加1.26倍，两种对照饮片均增加60%左右。由于加入辅料炮制，淡附片中带入了甘草成分甘草苷和芒柄花苷。结论甘草和黑豆共制淡附片中的有效成分单酯型生物碱量明显高于甘草及黑豆分制的对照饮片。

附子；淡附片；甘草；黑豆；乌头碱

附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的子根加工品， 《中国药典》2010年版（以下简称 “药典”）收载的淡附片是漂尽盐分的盐附子与甘草、黑豆煮制而得［1］。历代均曾有医家将甘草和黑豆应用于附子炮制， 《景岳全书》［2］记载 “……用甘草者，盖以附子之性急，得甘草而后缓；附子之性毒，得甘草而后解；附子之性走，得甘草而后益心脾；附子之性散，得甘草而后调营卫……”。甘草具有解毒、调和诸药之功，黑豆具有益精、解毒之功。现代药理研究表明，甘草可通过提高附子的中毒剂量、促进药物代谢、降低各肠段对附子成分的吸收、保护心肌细胞、降低附子的毒性，并保持附子原有的抗心衰的作用［3-9］。目前，尚未见甘草、黑豆炮制对盐附子的外观性状和酯型生物碱影响的研究报道，本研究按照药典附子项下淡附片炮制方法制备了淡附片及甘草、黑豆单一辅料制的对照饮片，采用HPLC法检测3种双酯型生物碱和3种单酯型生物碱总量，采用HPLCMS分析成分组成，分析甘草、黑豆炮制对附子外观性状及物质基础的影响，为研究甘草、黑豆炮制附子科学内涵提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪（1100色谱泵，DAD检测器，自动进样器，在线脱气，LC/MSP Trap XCT Plus）；超声波清洗器（SB25-12DTDN型宁波新芝生物科技股份有限公司）；循环多用真空泵 （SHB-3型，郑州长城科工贸有限公司）；旋转蒸发仪 （RE-52型，上海振捷实验设备有限公司）；手持折光盐度计 （上海天垒仪器仪表有限公司）。

1.2 试药 乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品供含量测定用，购自中国食品药品检定研究院 （批号分别为：110720-201111、110798-201106、110799-201106、111794-201102、111795-201002、111796-201002）。乙腈、四氢呋喃为色谱纯 （德国Merck公司）；水为纯净水；其他试剂均为分析纯。盐附子购自四川江油中坝附子科技发展有限公司，经中国食品药品检定研究院中药所张继主任药师鉴定为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的子根的加工品。甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch的干燥根和根茎，黑豆为豆科植物大豆Glycinemax（L.）Merr.的干燥成熟种子，均购自北京同仁堂药店。

2 方法与结果

2.1 炮制品的制备 按照药典附子项下淡附片炮制方法制备淡附片，取盐附子，用清水浸漂，每日换水2～3次，至盐分漂尽，与甘草、黑豆加水共煮透心，至切开后口尝无麻舌感时，取出，除去甘草，黑豆，切薄片，晒干。

按照上述方法，分别制备单一辅料甘草制对照饮片和黑豆制对照饮片。

以上炮制品分别粉碎，过三号筛，备用，各炮制品重复制备1次。

2.2 炮制品外观性状的观察 淡附片外皮褐色，切面褐色，半透明，有纵向导管束，质硬，断面角质样，味淡，口尝无麻舌感，符合 《中国药典》2010年版对淡附片外观性状的要求。甘草制对照饮片、黑豆制对照饮片的外观性状与淡附片基本一致。

2.3 6种生物碱的测定

2.3.1 供试品溶液的制备 取盐附子粉末约2 g，精密称定，加入异丙醇-乙酸乙酯 （1∶1）混合溶液50mL、氨试液3mL，精密称定质量，超声处理（功率300W，频率40 kHz，水温在25℃以下）30 min，放冷，再称定质量，用异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液补足减失的质量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25mL。40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入异丙醇-三氯甲烷 （1∶1）混合溶液3 mL溶解，滤过，取续滤液，即得。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取适量3种双酯型生物碱和3种单酯型生物碱对照品于10 mL量瓶中，加入异丙醇-三氯甲烷 （1∶1）混合溶液，定容，配制成含乌头碱161μg/mL、次乌头碱362 μg/mL、新乌头碱335μg/mL、苯甲酰乌头原碱81 μg/mL、苯甲酰次乌头原碱79μg/mL、苯甲酰新乌头原碱188μg/mL的溶液，备用。

2.3.3 色谱条件 Agilent Extend C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流动相A为0.1 mol/L醋酸铵溶液 （每1 000 mL加冰醋酸0.5 mL），流动相B为乙腈-四氢呋喃 （25∶15），梯度洗脱 （0～13 min，5%～15%B；13～54 min，15%～24%B；54～55 min，24%～35%B），检测波长为235 nm，柱温为22℃，体积流量为1 mL/min，进样量为10μL。

2.3.4 线性关系考察 取 “2.3.2”项下所配对照品溶液并分别精密移取2、1、0.5、0.2、0.1、0.05 mL于10 mL量瓶中，加入异丙醇-三氯甲烷（1∶1）混合溶液，定容，备用。取各质量浓度混合对照品溶液按照 “2.3.3”项下色谱条件测定，记录色谱峰峰面积。以各成分进样质量浓度x（μg/mL）为横坐标，峰面积y为纵坐标绘制标准曲线，经计算得各成分回归方程，6种成分在一定范围内，线性良好，结果见表1。

表1 各成分线性关系考察Tab.1 Linear relationship of constituents

2.3.5 精密度 吸取同一混合对照品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件测定，连续进样6次，测得乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱峰面积，计算各成分峰面积的 RSD，结果分别为1.3%、1.1%、0.38%、1.4%、1.2%、0.60%，表明本法具有良好的精密度。

2.3.6 稳定性 取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、20、24 h进针，记录乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱的峰面积计算各成分峰面积的RSD，结果分别为1.0%、1.2%、0.97%、0.14%、1.5%、1.9%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.3.7 重复性 取同一批次盐附子粉末6份，按照 “2.3.1”项下方法分别制备供试品溶液，分别进样10μL，按照 “2.3.3”项下色谱条件测定6种成分的峰面积，测得供试品溶液中乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱的质量浓度分别为39.1、249、210、7.13、9.33、38.0μg/g。计算各成分含有量的 RSD，结果分别为 1.8%、2.5%、1.8%、2.1%、2.8%、2.0%，表明供试品溶液的制备方法重复性良好。

2.3.8 加样回收率 取已知含有量盐附子粉末6份，每份1 g，精密称定，分别加入含乌头碱161 μg/mL、次乌头碱362μg/mL、新乌头碱335 μg/mL的溶液0.5 mL，按照“2.3.1”项下制备供试品溶液，按照 “2.3.3”项下色谱条件依次测定，计算乌头碱、次乌头碱、新乌头碱平均回收率，结果分别为101%、101%、99.1%，RSD分别为2.7%、2.0%、2.7%。取已知含有量盐附子粉末6份，每份1 g，精密称定，分别加入含苯甲酰乌头原碱16.2μg/mL、苯甲酰次乌头原碱15.8 μg/mL、苯甲酰新乌头原碱37.6μg/mL的溶液1 mL，按照 “2.3.1”项下制备供试品溶液，按照“2.3.3”项下色谱条件依次测定，计算苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱平均回收率，结果分别为 102%、100%、100%，RSD分别为2.6%、2.9%、1.7%。

2.3.9 样品测定 分别取 “2.1”项下各样品粉末，按照“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，按照 “2.3.3”项下色谱条件进行检测，采用标准曲线法计算各成分，各炮制品色谱图见图1，测定结果见表2。

取稀释5倍的 “2.3.2”项下对照品溶液，按照 “2.3.3”项下色谱条件进行检测，色谱图见图1A，供样品中各成分定性指认。

分别精密吸取5.87 mg/mL苯甲酸溶液、异丙醇各10μL，按照 “2.3.3”项下色谱条件进行检测，结果表明图1中峰1为苯甲酸的色谱峰，峰2为溶剂中异丙醇的色谱峰。

图1 对照品 （A）、淡附片 （B）、甘草制对照饮片 （C）和黑豆制对照饮片（D）HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram s of reference substance（A），Danfupian（B）and two single auxiliary material prepared products（C、D）

采用Spss 16.0软件对炮制后的淡附片、甘草制对照饮片和黑豆制对照饮片中的双酯型生物碱总量和单酯型生物碱总量分别做方差分析，两类成分的分析结果均为：淡附片与甘草制对照饮片、黑豆制对照饮片两两比较均P＜0.05，具有显著性差异，甘草和黑豆2种对照饮片之间P＞0.05，无显著性差异。

2.4 高效液相图谱中未知成分峰的MS检测

表2 各炮制品中双酯型生物碱总量、单酯型生物碱总量 （%，n=2）Tab.2 Contents of diester alkaloid and monoester alkaloid in p repared products（%，n=2）

2.4.1 质谱条件 Agilent Extend C18色谱柱（4.6 mm×250mm，5μm）；5mmol/L醋酸铵溶液（每1 000 mL加冰醋酸60μL） （A）-乙腈（B），梯度洗脱，检测波长为235 nm，柱温为22℃，体积流量为1 m L/min，进样量为10μL，正电离电压为3 000 V，负电离电压为4 000 V，干燥器体积流量为11.0 L/min，干燥器温度为350℃，分别采用正、负离子模式进行检测。

2.4.2 MS检测 淡附片和甘草制淡附片的HPLC色谱图中，在25～26 min之间出现了一个新的峰（图1峰9），说明加入辅料炮制后，使淡附片的物质组成发生变化，按照 “2.3.1”项方法制备供试品溶液，按 “2.4.1”项下质谱方法进一步对该峰进行定性鉴别研究，检测结果见图2、3，在该条件下检测，质谱信息表明该峰为两个成分的混合峰。

图2 未知成分（一）的MS定性鉴别Fig.2 Identification of unknown com ponents I by MS

图3 未知成分（二）MS定性鉴别Fig.2 Identification of unknown components IIby MS

未知成分 （一）正离子检测模式：419［M+ H］+、257［M-Glu+H］+、457［M+K］+、238［M-Glu+H-H2O］+。负离子检测模式：417［MH］-、254［M-Glu］-。结合质谱所得碎片分子质量和信息推测未知成分中含有甘草苷［10］。

未知成分 （二）正离子模式：489［M+ CH3COO］-、266［M-CH3COO-Glu］-、251［MCH3COO–Glu-CH3］-。负离子检测模式：431［M-H］-、268［M-Glu］-。结合质谱所得碎片分子质量和信息推测未知成分中含有芒柄花苷［11］。

3 小结与讨论

乌头类药材的减毒原理为乌头碱等双酯型生物碱脱去乙酸，生成苯甲酰乌头原碱等单酯型生物碱，单酯型生物碱可继续水解脱去苯甲酸，生成乌头原碱等氨基醇型乌头原碱，上述各步骤水解反应的物质的量的比均为1∶1。现代药理研究表明，氨基醇型生物碱在强心、抗炎方面具有生理活性［12-14］，有必要对其进行定量测定，但是，这类生物碱无共轭结构，不具有紫外吸收，而另外的二级水解产物苯甲酸则可以通过紫外-可见检测器检测并定量。目前，已有研究将苯甲酸用于间接测定氨基醇型生物碱的含量［15］。因此，本研究对苯甲酸进行了定性检测，为表示双酯型生物碱的二级水解情况提供依据。

淡附片的外观性状符合药典的规定，甘草、黑豆单一炮制的对照饮片的外观性状与淡附片基本一致。本研究的炮制对象为盐附子，盐附子经产地加工后，断面颜色由白色变为灰褐色，煮制后，颜色加深至褐色，而辅料煮后的液体颜色为黄色，不会导致炮制品颜色发生明显变化；附子富含淀粉，煮制过程中，淀粉糊化，干燥后，质地变为角质样、质硬，上述炮制品均按药典要求煮制透心，因此，三者质地均为角质；此外，煮制透心与否可直接影响炮制品的麻舌感，煮制透心后，饮片无麻舌感。因此，双辅料或者单一辅料炮制后的外观性状没有显著差异。

淡附片中的毒性成分双酯型生物碱较炮制前的盐附子降低了约97%；单酯型生物碱较盐附子增加了约1.26倍，而甘草制对照饮片及黑豆制对照饮片的双酯型生物碱均降低了约98%，单酯型生物碱均增加了约0.6倍，由甘草黑豆两种辅料共同炮制的淡附片所含的单酯型生物碱的总量明显高于甘草或黑豆单一辅料炮制品。

在淡附片中检测到的未知峰9，与甘草制对照饮片的峰9保留时间基本一致，经HPLC-MS法初步证实该峰可能是加入甘草炮制带入的甘草苷、芒柄花苷等成分，表明加辅料炮制会影响附子的物质组成。

双辅料炮制或者甘草、黑豆单一辅料炮制对外观性状没有明显的影响，以外观性状为指标无法分析双或单一辅料炮制品之间的差异。甘草、黑豆共同制备淡附片提高单酯型生物碱的总量，增强药效；同时，带入辅料成分，可能会影响附子的药效，但其加辅料炮制机理尚待深入研究。

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Effect of adjuvants on trait and the ester alkaloid from salt-Fuzi

GUOWei， TAN Peng， WU Yue-jiao， QIN Yu-xin， ZHAO Ling-ling， LIFei*
（Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

AIMTo study the effect of Gancao（Glycyrrhizae Radix et Rhizoma）and Heidou（Sojae Semen nigrum）on traitand their ester alkaloids of salt-Fuzi（Aconiti lateralis Radix praeparata）.METHODSDanfupian（saltfree-Fuzi）and Fuziprocessed with Gancao and with Heidou were prepared consistentwith China Pharmacopeia.Three diester alkaloids and threemonoester alkaloids from processed Fuziwere determined by HPLC，and HPLC-MSwas used for the component analysis.RESULTSAs compared with salt-Fuzi，diester alkaloids contents from three processed Fuzi decreased about 97%.Three monoester alkaloids from Danfupian increased about 1.26 time，of Fuziprocessed with Gancao and with Heidou only rose about60%.Adding adjuvantsmade Danfupian contain liquiritin and ononin contentswhich originated from Gancao.CONCLUSIONMonoesteralkaloids content from Danfupian processed by Gancao and Heidou is higher than that processed separately.

Fuzi（Aconiti lateralis Radix praeparata）；Danfupian；Gancao（Glycyrrhizae Radix et Rhizoma）；Heidou（Sojae Semen nigrum）；aconitine

R283.1

：A

：1001-1528（2015）06-1289-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.028

2014-11-27

中医药行业科研专项项目 （201107008）；国家自然科学基金课题 （81102807）；国家973计划中医基础理论专项（2009CB522800；2009CB522805）

国 伟（1990—）女，硕士生，研究方向为中药炮制。Tel：15810627628，E-mail：guoweizaizai@163.com

*通信作者：李 飞（1963—），教授，研究方向为中药炮制。Tel：13601291660，E-mail：lf668@sina.com