紫山药组织培养快繁技术研究

王碧琴 周华 朱祺 刘腾云 余发新

摘要：以紫山药的茎尖、茎段为材料，对茎尖、茎段诱导分化不定芽进行初步研究，结果表明，茎尖、茎段不定芽的分化率随6-BA浓度的增加而提高，芽苗增殖率先由低到高，再降低；MS+6-BA0.5～1.0mg/L+NAA0.1mg/L培养基对不定芽有较高的分化率和增殖率；茎尖、茎段培养20d为1个继代周期，茎段在第2次继代期、茎尖在第3次继代周期培养时，不定芽的增殖率最高；不定芽苗2.0～3.0cm时从苗基部或分枝处剪下进行生根诱导，生根率在95%以上。

关键词：紫山药；茎尖；茎段；组织培养；不定芽

中图分类号：S632.104+.3文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0048-03

紫山药俗称薯蓣、脚板薯、长芋，为薯蓣科薯蓣属（Dioscorea）的一个地方品种，为多年生蔓性植物，块根呈块状或圆柱状，表皮和肉质因呈紫紅色而得名。紫山药肥大的肉质块根细腻滑爽、口感极佳，富含黏性蛋白、紫色花青素、维生素、胆碱和薯蓣皂（天然的DHEA）等，内含各种荷尔蒙基本物质，有促进内分泌荷尔蒙的合成等多种独特食疗价值，也称“紫人参”。据《本草纲目》记载，经常食用紫山药，不仅可以增加人体的抵抗力，降低血压、血糖，抗衰益寿等，而且还具有固肾、润肺益精、软化血管等药用滋补功能，故又享有“蔬菜之王”的美誉。病毒病是造成山药产量下降、品质退化的重要因素。紫山药由于长期使用块茎繁殖，出现病毒积累，种性退化，已危及到产品品质和产量，不但满足不了市场需求，还严重影响和制约地方产业的发展和种植的积极性。山药感染的主要病毒有坏死花叶病毒、绿色斑驳病毒、马铃薯Y病毒和马铃薯卷叶病毒[1]，目前尚无有效药物可控制这些病毒病的发生或蔓延。采用现代生物技术，选取优良无病株种苗进行离体脱毒培养，以组培苗更替传统的营养繁殖可以从根本上解决病毒病的问题。有关盾叶薯蓣、惠楼山药、怀山药等组织培养与快繁的研究[2-5]已见报道，紫山药组织培养快繁技术研究还末见报道。为此，本试验开展紫山药组织培养快繁技术研究，以期为紫山药组培苗工厂化生产和应用提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

紫山药，由江西万载辉明有机农业科技开发有限公司提供。选择个大无病虫、表面根毛少、肉紫色的块茎，经表面消毒，在室（棚）温15～25℃于盆中沙藏催芽30d左右，待嫩芽生长到20～30cm即可作为外植体取材。

1.2试验方法

1.2.1培养基初始培养基：MS；诱导分化培养基：MS+6-BA0.1～2.0mg/L+NAA0.1mg/L；生根培养基：1/2MS+NAA0.1～0.5mg/L+Ac0.2g/L。所用培养基均含45g/L食用糖和琼脂6g/L，pH值为5.8。培养基在121℃、131kPa条件下灭菌25min，备用。

1.2.2外植体消毒去掉展开的叶片，分别剪成带叶柄的茎段、茎尖；用洗液清洗干净，在无菌操作台上用70%乙醇消毒30s，无菌水冲洗数次；分别用0.1%HgCl2浸泡消毒，茎尖5min、茎段10min，用无菌水冲洗数次。

1.2.3茎尖和茎段的初始培养茎段带节剪成0.8～1.0cm的小段，共72段，茎尖剪留0.5～0.8cm，共30个；分别接种于初始培养基上，培养30d后统计枯死率和成活率。

1.2.4激素浓度对茎尖、茎段的诱导分化初始培养的茎段腋芽抽长2.0cm时，将新抽枝从基部剪下，每茎段0.5cm左右，带叶柄接种在不同激素浓度的诱导分化培养基上，每处理接种30茎段；初始培养的茎尖修剪基部褐化的部分，取茎尖0.3cm左右，接种在不同激素浓度的诱导分化培养基上，每处理接种12茎尖。茎尖、茎段培养20d，新鲜培养基继代1次，40d后观察不定芽变化，并统计诱导分化率、不定芽数和增殖率。

1.2.5培养周期对茎尖、茎段的诱导分化再生茎尖、茎段（含不同株系紫山药1#、2#）各30个，接种在MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L的诱导分化培养基上，每培养20d为1个继代周期，共继代4次，统计不定芽数和增殖率。

1.2.6生根培养剪取不定芽苗2.0～3.0cm，接种于生根培养基诱导生根，20d后统计生根数。

1.3培养条件

接种后的试材，均在温度（25±2）℃、光照度1200lx、光照时间10h/d条件下培养。

2结果与分析

2.1茎尖、茎段的初始培养

外植体接种在初始培养基上培养2～3d，基部开始变褐，培养基出现褐化，褐色物渗入培养基呈圆形；培养10～15d，外植体基部褐化加重，部分茎尖变褐、枯死，茎段基部1/3处枯死；培养20d，茎尖枯死率为17%，茎段枯死率为7%，外植体基部的茎节处肿大，并有淡红色圆形芽点，茎段叶柄张开，腋芽开始萌动；培养30d左右，茎段叶腋抽生1～2个不定芽，长0.5～2.5cm，稍嫩的茎段叶腋形成0.1～0.2cm小瘤状物，茎尖、茎段成活率分别为43%和91%。

2.26-BA浓度对茎尖、茎段诱导分化的影响

茎尖0.3cm、茎段0.5cm分别接种在不同6-BA浓度的诱导分化培养基上，培养3～5d，茎段切口处分泌褐色物，在培养基中扩散由浅褐至深褐；培养10～15d，茎段基部增粗，叶柄张开，腋芽萌发单个或多个不定芽小点，单个不定芽伸长，生长较快，不定根长2～4cm，不定芽长2.0cm，随激素浓度的加大，茎段形成的丛生芽体数增多，最多可达5～7个，茎尖由于个体小，分化的芽点也小，分化率虽高，但能形成正常的小芽少，随培养时间的延长，部分小芽可生长成正常芽，但芽体较弱、矮小或畸型；培养20d左右，不定芽基部生长1～3条淡红色不定根，不定根生长快，可直接伸入培养基分泌酚类化合物，受多酚氧化酶激活产生醌类物质，加重培养基褐化程度。由表1可见，6-BA浓度为0.1mg/L时，茎尖、茎段诱导分化率和增殖率均最低，分别为90%、0%和93%、123%；6-BA浓度为1.0mg/L时，茎尖、茎段诱导增殖率均为[KG*5]最高，分别为50%和250%；茎尖和茎段在MS+6-BA培养基中培养，既能保持一定的分化率又有较好的不定芽增殖率。

2.3培养周期对茎尖、茎段诱导分化的影响

试验结果表明，茎段培养15～20d，不定芽由茎段基部叶腋、隐芽分化，或由腋芽直接分化形成不定芽，茎尖仅在叶腋处膨大，露出小小的芽点；培养40d（2次继代），茎段不定芽长0.5～1.0cm，不定芽增殖数达到高峰，增殖数达到42个，后不定芽增殖系数逐步下降；随着培养时间延长，不定芽增多，形成多个多芽体（图1），茎节处有少量不定根；培养60d（第3次继代），茎段苗高2.0～4.0cm，基部1～2节处有多条不定根，并有多芽体丛生现象，基部不定芽分化基本停止，茎秆节腋处产生重叠多芽体，芽体茎秆细小，不利于作次代增殖材料，茎尖叶腋形成多个不定芽，增殖数随培养时间延长不定芽增多，增殖数由少到高并回落，茎尖培养60d时不定芽增殖数为最高，增殖数达到40个（表2）；随着培养继代次数的增加，不定芽增殖数增加，出现枝上生芽的多芽体现象。

2.4对不同株系茎段诱导分化的影响

紫山药不同株系从试管苗外观上进行区别，1#茎秆粗壮、淡绿色，叶片绿色，2#茎秆稍细、紫色，叶深紫色（图2、图3）。在培养过程中，紫山药1#茎段愈伤组织较松软，诱导不定芽时间短，需7～10d，产生不定芽2～3个，且生长伸长快，容易形成多芽体现象；紫山药2#愈伤茎段组织质地较硬，诱导不定芽时间长，需15～20d，不定芽为单个生长，伸长慢，芽体小，增殖系数也少（表3）。紫山药1#芽体每继代周期的增殖系数是紫山药2#的1.54倍，有利于建立快繁体系。这种不同的诱导分化效果，与材料本身的生理遗传基因-植物受体多样性及与内源激素的合成和代谢差异有密切关系[6-9]。

2.5不定芽的生根诱导培养

由图4可见，在生根培养基培养7～10d，小苗基部开始着生1～3条白或水红色细长的根，15d后根在培养基底部长达10cm；小苗叶片大，色质光绿，叶柄长，小苗主侧枝伸长，茎节上不断有不定根形成。20d后生根率在95%以上，此時，可移出培养室，在自然光下炼苗3～5d，用水洗净琼脂，移栽至营养钵。

3小结

紫山药外植体接种后由自养变为异养，细胞代谢发生变化，产生了一些酚类化合物，这些酚类物质受多酚氧化酶激活，被氧化后产生呈粽褐色的醌类物质，随着外植体的伤口或愈伤组织逐步从组织扩散到培养基中，影响外植体器官的分化，严重时会使组织死亡。茎尖组织比较幼嫩，抗醌类物质毒害较弱，在培养过程中容易褐化死亡。因此，外植体在接种后需釆用7～10d继代（更换）1次培养基。

培养基中高浓度激素是加剧外植体褐变的因素。在次生茎段分化增殖培养中，当6-BA浓度为1.0～2.0mg/L时褐化较重，每15d左右就需继代1次培养基；当6-BA0.5mg/L时褐化较轻，一般20～25d更换1次培养基有利于细胞的正常分化。在一定范围内，激素浓度与次生茎段诱导分化率成正比，激素浓度越高，分化的不定芽越多。培养继代的次数越多，产生不定芽多芽体也多，尤其在不定芽2次继代后比较明显，这与晏婴才等的研究结论[2]基本相似。

从不定芽增殖量上看，外植体茎尖诱导分化的不定芽数量多于茎段。从生物遗传角度及农艺性状上分析，茎尖诱导分化的不定芽变异性大，对改良品种、选育新品种比较适合，茎段快繁能保持品种的品性，有利于提高品种的优良品质。因此，在利用组织培养技术时，应根据需求目的，选择适合的培养方式来建立无性快繁体系。

参考文献：

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