发酵性结合酵母菌对重金属吸附能力的研究

赖颖+赵锦慧+杨同文+潘明君

摘要：以海藻酸钠和聚乙烯醇作为包埋剂对发酵性结合酵母菌进行固定化，采用单一变量法研究溶液的pH值、金属离子初始浓度、菌体浓度、吸附时间、吸附温度5种因素对固定化酵母菌吸附Pb2+和Zn2+离子的影响。结果表明，发酵性结合酵母菌对Pb2+、Zn2+吸附的最佳条件是：pH值4.0，金属离子初始浓度0.25μg/mL，酵母菌浓度2.0g/L，吸附时间15min，吸附温度30℃。发酵性结合酵母菌对Pb2+和Zn2+有较好的吸附能力，是良好的生物吸附剂。

关键词：发酵性结合酵母菌；吸附；重金属；Pb2+；Zn2+

中图分类号：X703文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0398-03

重金属是造成水体污染的一类有毒物质[1]。由于含重金属的工业废水的排放量不断增加，这些废水被排入水体和土壤中，会对环境和人类的健康造成极大的威胁，因此，必须处理后再进行排放[2]。生物吸附法有利于解决这一难题，利用微生物吸附废水中的重金属在投资、运行、操作管理和重金属回收、水回用等方面优越于传统的治理方法[3]。目前，能够作为生物吸附剂的微生物有细菌，真菌，藻类[4]，由于酵母菌广泛应用于食品饮料工业，廉价易得且安全，有利于生物吸附的工业化应用[5]，所以酵母菌是生物吸附剂的首选。但有关发酵性结合酵母菌对重金属吸收能力的研究未见报道。本试验以从宋河酒曲中筛选出来的发酵性结合酵母菌为试验菌种，研究固定化发酵性结合酵母菌对Pb2+、Zn2+离子吸附的最佳条件，为利用该吸附工业废水中重金属菌种的开发和应用提供参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种发酵性结合酵母菌菌种A27，周口师范学院发酵工程实验室提供。

1.1.2主要仪器

恒温振荡器HZQ-X300，上海一恒科学仪器有限公司产品；型电热鼓风干燥箱101-1，北京科伟永兴仪器有限公司产品；电子天平AL204，梅特勒托利多仪器（上海）有限公司产品；pH值计EL20，梅特勒托利多仪器（上海）有限公司产品；系列生化培养箱THZ-98AB，昆山一恒仪器有限公司产品；超净工作台JJ2010-04-108，苏州市金净净化设备科技有限公司；紫外可见分光光度计UV-5100，上海元析仪器有限公司。

1.1.3主要试剂硝酸铅、氯化锌、氯化钙、硼酸、海藻酸钠、聚乙烯醇（PVA）、双硫腙、四氯化碳、硫代硫酸钠、甲基红、氨水、乙酸、四氯化碳、酚红、三氯甲烷均为分析纯。

1.1.4溶液的配制锌标准溶液：称取0.2092g氯化锌移入100mL的容量瓶，加水稀释至刻度，每1mL相当于1mgZn2+。

锌标准使用液[6]：取1.0mL的锌标准溶液于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，每1mL溶液相当于10μgZn2+。

铅标准溶液：称取0.1598g硝酸铅移入100mL的容量瓶，加水稀释至刻度，每1mL相当于1mgPb2+。

铅标准使用液：取1.0mL的铅标准溶液于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，每1mL溶液相当于10μgPb2+。

25%硫代硫酸钠：称取25g硫代硫酸钠，溶解于100mL蒸馏水中。

0.1%甲基红：称取0.1g甲基红，用60mL95%乙醇溶解，加蒸馏水定容至100mL。

乙酸溶液：取10mL冰乙酸溶于70mL蒸馏水中。

0.1%双硫腙四氯化碳溶液：称取0.10g双硫腙，用四氯化碳溶解至100mL，倒入棕色瓶，置于冰箱中保存。临用前，吸取适量双硫腙四氯化碳溶液，加四氯化碳稀释30倍，即可使用。

双硫腙三氯甲烷溶液：称取100mg双硫腙，溶于1000mL三氯甲烷中，此溶液每1mL含100μg双硫腙，保存于冰箱备用。临用前取适量上述双硫腙三氯甲烷溶液，置50mL容量瓶中，用三氯甲烷稀释定容。

0.1%酚红指示剂：取酚红0.1g，加入氢氧化钠溶液2.82mL使其溶解，再加入蒸馏水至100mL。

乙酸-乙酸钠缓冲溶液：称取68g乙酸钠，用蒸馏水溶解至250mL。冰乙酸取31mL，加蒸馏水至250mL，以上二者混合。

1.1.5培养基

马铃薯培养基[7]：将马铃薯洗净去皮，切块，称取600g于干净的大烧杯中，加入1000mL蒸馏水煮30min，经8～12层纱布过滤，取马铃薯过滤液，加入60g葡萄糖，溶解后用蒸馏水稀释至1200mL，分装于250mL三角瓶中，在121℃条件下灭菌20min，保存备用。

1.2方法

1.2.1酵母菌干粉的制备

在无菌操作台中，挑取3环平板培养基中的发酵性结合酵母菌A10，接种到灭菌的马铃薯培养基中，在振荡培养箱中温度为28℃、转速为150r/min条件下振荡培养24h。将该培养液作为种子液，放入冰箱保存，备用。在无菌操作台中，移取种子液15mL，加入到已灭菌的马铃薯培养基中，在温度为28℃、转速为150r/min的条件下，在振荡培养箱中振荡培养20h。将培养液在离心机中以转速为4000r/min离心5min，收集菌体，在鼓风干燥箱中以50℃下烘干，用研钵研磨成粉末状，干燥保存。

1.2.2酵母菌的固定化方法

海藻酸钠-聚乙烯醇包埋法：称取1g海藻酸钠和2g聚乙烯醇于干净无菌的小烧杯中，加入少许的蒸馏水，调成糊状，再加水至20mL，将小烧杯在电炉上加热溶解，然后冷却至室温，再加入一定量的酵母菌干粉混合均匀，用20mL医用注射器吸取混合物，以恒定的速度滴到4%的氯化钙饱和硼酸溶液中，浸泡约4h后，将固定化的酵母菌小球移入三角瓶中，用无菌去离子水洗涤4次后，加入已配制好的溶液中[8]。

1.2.3金属离子浓度的测定endprint

铅测定方法[9]：取待测溶液1mL于60mL的分液漏斗中，各加蒸馏水稀释至10mL。各加2滴酚红指示剂，用1∶1氨水调至红色，加10mL双硫腙三氯甲烷溶液，振荡，静置分层后将三氯甲烷层经脱脂棉滤入1cm比色杯中，以三氯甲烷调节零点，于波长510nm处测得吸光度。

锌测定方法[10]：取1mL待测溶液置于60mL分液漏斗中，各加蒸馏水稀释至10mL，滴加甲基红，摇匀，用1∶1氨水调至刚显黄色，再滴加乙酸至红色，再向分液漏斗中加5mL四氯化碳，振摇萃取甲基红，弃去下层的有机相。向各分液漏斗中加入5mL乙酸钠缓冲溶液及lmL硫代硫酸钠溶液，混匀后再加10mL双硫腙四氯化碳溶液，振摇4min，静置分层后，将四氯化碳层通过少许洁净脱脂棉过滤入比色皿中，在535nm的最大吸光波长处测量溶液的吸光度。

1.2.4Pb2+、Zn2+的吸附

将固定化小球分别加入需要进行吸附的Pb2+和Zn2+溶液中，用1mol/LHCl和1mol/LNaOH调节溶液的pH值[11]，于室温下吸附一定的时间，然后取上清液，用双硫腙可见分光光度法测定上清液中的Pb2+和Zn2+的浓度，计算吸附率：

吸附率=吸附量/总量×100%=（总量-吸附后的量）/总量×100%。

1.2.5pH值对吸附率的影响

分别取Pb2+、Zn2+离子溶液100mL，浓度均为0.30μg/mL（分别取3.0mL锌标准使用液和铅标准使用液于容量瓶中，加蒸馏水定容到100mL），用1mol/LHCl和1mol/LNaOH调节pH值为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，再分别加入菌体浓度为1.0g/L的固定化酵母菌小球，室温下吸附20min，取上清液，用可见分光光度计测吸光度，计算吸附率[12]。

1.2.6金属离子初始浓度对吸附率的影响

将固定化酵母菌置于不同浓度的Pb2+、Zn2+离子溶液中。其中，Pb2+、Zn2+离子浓度各自分别为0.1，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35μg/mL。调节pH值为4.0，各加入菌体浓度为1.0g/L固定化酵母菌小球，室温下吸附20min，取上清液，用可见分光光度计测吸光度，计算吸附率。

1.2.7菌体浓度对吸附率的影响

Pb2+、Zn2+离子初始浓度均为0.25μg/mL溶液（分别取2.5mL锌标准使用液和铅标准使用液于容量瓶中，加蒸馏水定容到100mL），pH值为4.0，菌体浓度分别为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0g/L，室温下，吸附20min，吸附后取上清液，用可见分光光度法测吸光度，计算吸附率。

1.2.8吸附时间对吸附率的影响

取Pb2+、Zn2+离子初始浓度均为0.25μg/mL溶液（分别取2.5mL锌标准使用液和铅标准使用液于容量瓶中，加蒸馏水定容到100mL），pH值为4.0，加入菌体浓度2.0g/L固定化酵母菌小球，在室温下，分别吸附5、10、15、20、30、40min，取上清液用可见分光光度计测吸光度，计算吸附率。

1.2.9温度对吸附率的影响

取Pb2+、Zn2+离子初始浓度均为0.25μg/mL溶液（分别取2.5mL锌标准使用液和铅标准使用液于容量瓶中，加蒸馏水定容到100mL），pH值为4.0，加入菌体浓度2.0g/L固定化酵母菌小球，分别在20、25、30、35、40、45℃下吸附15min，吸附后取上清液，用可见分光光度法测吸光度，计算吸附率。

2结果与分析

2.1pH值对发酵性结合酵母菌吸附重金属能力的影响

由图1可知，在pH值3.0～5.5，固定化酵母菌对Pb2+、Zn2+的吸附率都超过了80%。随着溶液pH值增大，吸附率呈先升高后降低的趋势。固定化酵母菌对Pb2+的吸附：当pH值<4.0时，固定化酵母菌对Pb2+的吸附率随pH值升高而升高，当pH值为4.0时，达到最大吸附率（86.5%），当pH值大于4.0时，固定化酵母菌的吸附率随pH值的升高而降低；固定化酵母菌对Zn2+的吸附：当pH值从3.0升至5.5时，固定化酵母菌对Zn2+的吸附率随pH值增大而先增大后减小，在pH值为4.0时，吸附率达到最大（85.7%）。其原因有可能是pH值低时，细胞表面基团被H3O+占据，阻碍了金属离子对细胞的靠近和活性基团的解离，致使吸附率低；在高pH值条件下，H+浓度降低，使细胞表面暴露更多的吸附位点，但重金属离子会以不溶解的氧化物、氢氧化物微粒的形式存在，从而使吸附过程无法进行。由此可见，酵母菌对重金属离子吸附的最佳pH值为4.0。

2.2重金属离子初始浓度对发酵性结合酵母菌吸附性能的影响

由图2看出，当菌体浓度一定时，固定化酵母菌对重金属离子的吸附率总体上是随着初始浓度的升高呈先升高后降低的趋势，其原因有可能是当重金属离子达到一定浓度时，菌体上的金属离子结合位点已被饱和，固定化酵母菌对金属离子的吸附量就不再增加，同时当重金属离子达到一定浓度时，重金属对酵母菌有毒害作用。

Pb2+的初始浓度在0.10～0.25μg/mL时吸附率随着浓度的升高而升高，当初始浓度大于0.25μg/mL时，吸附率缓慢降低；但Zn2+初始浓度由0.1μg/mL增加到0.25μg/mL时，酵母菌对Zn2+的吸附率变化不大，当初始浓度大于0.25μg/mL时，吸附率降低幅度较大。

2.3菌体浓度对发酵性结合酵母菌吸附性能的影响

在重金属离子初始浓度一定的条件下，随着菌体浓度的增加，酵母菌对重金属离子Pb2+、Zn2+的吸附率先增大然后减小，当菌体浓度为2.0g/L时吸附率最大（图3）。其原因可能是在一定范围内增加生物量，可以使吸附位点增加，从而使吸附率增加；当生物量超过一定值时，导致了吸附位点间的相互作用，从而减少了一部分有效的吸附位点。endprint

2.4时间对发酵性结合酵母菌吸附性能的影响

结果（图4）表明，随着吸附时间的增加，酵母菌菌体对Zn2+、Pb2+离子的吸附率逐渐增加，当吸附时间大于15min时，菌体对重金属离子的吸附率趋于稳定。这可能因为随着时间的增加，菌体上的重金属离子吸附位点逐渐饱和。

2.5温度对发酵性结合酵母菌吸附性能的影响

结果（图5）表明，随着温度的升高，固定化酵母菌对Pb2+的吸附率并无明显规律，但当温度在30℃左右时，固定化酵母菌对Pb2+的吸附效果比较好，而固定化酵母菌对Zn2+的吸附率在20～30℃时随着温度的升高而上升。这是由于生物吸附Zn2+的过程是个放热的过程。

3结论

以海藻酸钠和聚乙烯醇作为包埋剂固定化的发酵性结合酵母菌A27对Pb2+和Zn2+重金属离子具有较强的吸附能力。在相同的条件下，固定化发酵性结合酵母菌A27对Zn2+的吸附率比对Pb2+的吸附率大。发酵性结合酵母菌对Pb2+和Zn2+重金属离子的吸附率受溶液pH值、菌体浓度和重金属离子的初始浓度这3个因素影响较大。本试验结果表明，发酵性结合酵母菌对重金属的最佳吸附条件是：pH值4.0，Pb2+、Zn2+离子的初始浓度均为0.25μg/mL，酵母菌浓度2.0g/L，吸附时间15min，吸附温度30℃。

参考文献：

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[8]梁峙，赵孝华.海藻酸钠固定化酵母菌的应用研究[J].食品工业科技，2002，23（12）：34-35.

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[12]王会霞，尹华，彭辉.解脂假丝酵母对铜的吸附[J].生态科学，2004，23（4）：305-309.endprint

2.4时间对发酵性结合酵母菌吸附性能的影响

结果（图4）表明，随着吸附时间的增加，酵母菌菌体对Zn2+、Pb2+离子的吸附率逐渐增加，当吸附时间大于15min时，菌体对重金属离子的吸附率趋于稳定。这可能因为随着时间的增加，菌体上的重金属离子吸附位点逐渐饱和。

2.5温度对发酵性结合酵母菌吸附性能的影响

结果（图5）表明，随着温度的升高，固定化酵母菌对Pb2+的吸附率并无明显规律，但当温度在30℃左右时，固定化酵母菌对Pb2+的吸附效果比较好，而固定化酵母菌对Zn2+的吸附率在20～30℃时随着温度的升高而上升。这是由于生物吸附Zn2+的过程是个放热的过程。

3结论

以海藻酸钠和聚乙烯醇作为包埋剂固定化的发酵性结合酵母菌A27对Pb2+和Zn2+重金属离子具有较强的吸附能力。在相同的条件下，固定化发酵性结合酵母菌A27对Zn2+的吸附率比对Pb2+的吸附率大。发酵性结合酵母菌对Pb2+和Zn2+重金属离子的吸附率受溶液pH值、菌体浓度和重金属离子的初始浓度这3个因素影响较大。本试验结果表明，发酵性结合酵母菌对重金属的最佳吸附条件是：pH值4.0，Pb2+、Zn2+离子的初始浓度均为0.25μg/mL，酵母菌浓度2.0g/L，吸附时间15min，吸附温度30℃。

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[12]王会霞，尹华，彭辉.解脂假丝酵母对铜的吸附[J].生态科学，2004，23（4）：305-309.endprint

2.4时间对发酵性结合酵母菌吸附性能的影响

结果（图4）表明，随着吸附时间的增加，酵母菌菌体对Zn2+、Pb2+离子的吸附率逐渐增加，当吸附时间大于15min时，菌体对重金属离子的吸附率趋于稳定。这可能因为随着时间的增加，菌体上的重金属离子吸附位点逐渐饱和。

2.5温度对发酵性结合酵母菌吸附性能的影响

结果（图5）表明，随着温度的升高，固定化酵母菌对Pb2+的吸附率并无明显规律，但当温度在30℃左右时，固定化酵母菌对Pb2+的吸附效果比较好，而固定化酵母菌对Zn2+的吸附率在20～30℃时随着温度的升高而上升。这是由于生物吸附Zn2+的过程是个放热的过程。

3结论

以海藻酸钠和聚乙烯醇作为包埋剂固定化的发酵性结合酵母菌A27对Pb2+和Zn2+重金属离子具有较强的吸附能力。在相同的条件下，固定化发酵性结合酵母菌A27对Zn2+的吸附率比对Pb2+的吸附率大。发酵性结合酵母菌对Pb2+和Zn2+重金属离子的吸附率受溶液pH值、菌体浓度和重金属离子的初始浓度这3个因素影响较大。本试验结果表明，发酵性结合酵母菌对重金属的最佳吸附条件是：pH值4.0，Pb2+、Zn2+离子的初始浓度均为0.25μg/mL，酵母菌浓度2.0g/L，吸附时间15min，吸附温度30℃。

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