Box-Behnken 响应面法优化马钱子提取工艺

张文秀， 朱卫丰， 聂鹤云， 吴德智， 陈丽华， 管咏梅

(江西中医药大学 现代中药制剂教育部重点实验室，江西 南昌330004)

马钱子又称番木鳖，为马钱科植物马钱Strychnos nux-vomica L. 的干燥成熟种子。本品味苦，性温，有大毒，归肝、脾经，具有通络止痛、散结消肿功效，临床上主要用于跌打损伤、骨折肿痛、风湿顽痹、麻木瘫痪、痈疽疮毒、咽喉肿痛［1-2］。现代药理研究表面马钱子对中枢系统，心血管系统，免疫系统均有较强的药理作用［3-5］。其主要有效成分为总生物碱，士的宁(番木鳖碱)和马钱子碱占总生物碱的70% ～80%［6-7］。

Box-Behnken 响应面法(response surface methodology，RSM)是统计设计实验技术的合成，利用Box-Behnken 的实验设计并通过实验得到一系列数据，采用多元二次方程来拟合因素和效应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法［8］。与以往推广的正交设计法相比，RSM 统计设计可以评价指标和因素间的非线性关系，使用方便，条件预测性好，已广泛用于化学合成过程、药物处方筛选和剂型制备过程等的优化［9-10］。

前期文献调研发现，马钱子提取工艺优化主要以单因素考察，正交设计为主，未发现Box-Behnken 设计用于马钱子研究［11-12］。本实验采用Box-Behnken 响应面法对乙醇回流提取工艺中影响马钱子提取的关键因素进行优化，确定操作工艺可行的提取工艺，为后期马钱子制剂的开发奠定基础。

1 仪器与试药

Agilent 1200 Series 高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);KQ5200B 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);YF-103 高速中药粉碎机(瑞安市永历制药机械有限公司);TGL-16G 台式离心机(上海安亭科学仪器厂);BS124S 电子天平(德国赛多利斯科学仪器北京有限公司);ZNHW 型电热套(巩义市予华仪器有限公司);PH-3C pH 计(上海仪电科学仪器股份有限公司);HH-4 数显恒温水浴锅(国华电器有限公司);SZ-93 自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)。

马钱子碱对照品(纯度＞98%，中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，批号 M0-20111012);士的宁对照品(纯度＞98%，中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，批号S0-20130211)。磷酸二氢钾(国药集团化学试剂有限公司);庚烷磺酸钠(上海蓝季科技发展有限公司);盐酸(西陇化工股份有限公司);乙醇(纯度为95%，天津市大茂化学试剂厂);甲醇(美国天地公司);乙腈(美国天地公司)。沙烫马钱子饮片购于南昌市开心人大药房，经江西中医药大学中药鉴定学教研室龚千峰教授鉴定为马钱科植物马钱Strychnos nux-vomica L. 的干燥成熟种子。

2 方法与结果

2.1 马钱子碱、士的宁测定方法的建立

2.1.1 色谱条件 采用phenomenex C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);以乙腈-0.01 mol/L 庚烷磺酸钠与0.02 mol/L 磷酸二氢钾等量混合溶液(用10%磷酸调节pH 为2.8)(21 ∶79)为流动相;检测波长为260 nm［1］;柱温为35 ℃。在此条件下，2 个生物碱类成分分离度良好，结果见图1。

图1 马钱子药材和混合对照品HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms for Strychni Semen and mixed reference substances

2.1.2 对照品溶液制备 精密称定马钱子碱、士的宁置50 mL 量瓶中，加甲醇超声溶解后，静置，甲醇定容至50 mL，配成质量浓度分别为0.137、0.142 mg/mL 的混合对照品溶液A。精密吸取上述混合对照品溶液A 1、2、4、6、8 mL，分别置于10 mL 量瓶中，加甲醇定容，摇匀，作为混合对照品溶液B、C、D、E、F。将上述系列混合对照品溶液保存于4 ℃冰箱中，备用。

2.1.3 供试品溶液制备 取马钱子提取液，4 000 r/min 离心10 min，上清液过0.22 μm 微孔滤膜，精密吸取1 mL 滤液置于10 mL 量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得供试品溶液。

2.1.4 线性关系考察 精密吸取“2.1.2”项下6个质量浓度的混合对照品溶液，分别进样20 μL，以测得的响应信号(峰面积)对被测物质量作图，得到各成分的回归方程及线性范围。马钱子回归方程为Y =11 827X -2.212 9 (r =0.999 5，线性范围0.013 7 ～0.137 mg/mL);士的宁回归方程为Y=17 502X - 19.258 (r = 0.999 6，线性范围0.014 2 ～0.142 mg/mL)。结果表明，各对照品质量在一定范围内与峰面积线性关系良好。

2.1.5 精密度试验 取“2.1.2”项下对照品溶液，连续进样6 次，每次20 μL，记录马钱子碱和士的宁的峰面积，并计算各成分峰面积的RSD 值。结果马钱子碱的RSD 为0.6%，士的宁的RSD 为1.1% (n =6)。由于所得RSD 值均小于2%，故该仪器精密度较好。

2.1.6 重复性试验 取同一批马钱子提取液，按“2.1.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，分别进样，测定峰面积，计算各成分RSD。结果马钱子碱和士的宁RSD 分别为1.3%、1.5% (n=6)，所得RSD 值均小于2%，故该方法重复性较好。

2.1.7 稳定性试验 取同一份马钱子供试品溶液，分别于溶液制备后的第0、2、4、6、8、10、12、24 及36 h 进样，测定各成分峰面积RSD 值。结果马钱子碱、士的宁RSD 分别为0.7%，1.2%(n=9)，所得的RSD 值均小于2%，表明36 h 内供试品溶液稳定性良好。

2.1.8 加样回收率试验 取成分含有量已知的马钱子提取液1 mL 于10 mL 量瓶中，分别加入相当于马钱子提取液中马钱子碱、士的宁含有量0.8倍、1.0 倍、1.2 倍的马钱子碱、士的宁对照品，加甲醇定容，摇匀。每个剂量组平行制备3 份进样测定，并计算各成分的平均加样回收率及RSD 值。结果马钱子平均加样回收率为100.35%，RSD 为0.8%;士的宁平均加样回收率为99.57%，RSD 为1.2% (n=9)，表明该方法准确度良好。

2.2 马钱子提取工艺的优化

2.2.1 单因素试验

2.2.1.1 液料比考察 取马钱子粉末，每份15 g，分别加50% 乙醇6、8、10、12、14 倍，溶液用10%磷酸调pH 为5.0，煎煮1 h。随着溶剂量的增加马钱子综合效应值先升高后下降，当溶剂量增加到12 倍时综合效应值达到最大，因此最佳料液比为加入12 倍量的溶剂。

2.2.1.2 提取时间考察 取马钱子粉末，每份15 g，加10 倍量50%乙醇溶液，用10%磷酸调pH为5.0，不同煎煮时间(0.5、1、1.5、2 及2.5 h)条件下提取马钱子碱和士的宁。随着提取时间的增加马钱子综合效应值先升高后下降，当提取时间为1.5 h 时综合效应值达到最大，因此最佳提取时间为1.5 h。

2.2.1.3 乙醇体积分数考察 取马钱子粉末，每份15 g，加10 倍量的乙醇溶液，用10%的磷酸调pH 为5.0，不同乙醇体积分数 (40%、50%、60%、70%、80%)条件下提取马钱子碱和士的宁。随着乙醇体积分数的增加综合效应值先升高后下降，当乙醇体积分数为50%时综合效应值达到最大，因此最佳乙醇体积分数为50%。

2.3 Box-Behnken 响应面法优化马钱子回流提取工艺

2.3.1 试验设计与结果 文献和单因素试验结果显示，影响马钱子回流提取较显著的因素有乙醇体积分数、提取次数、提取时间和料液比。提取次数数据结果在模型拟合中，由于处理非连续变量比较困难，提取次数暂定为3 次。根据Box-Behnken 的中心组合试验设计原理对各因素进行3 水平试验设计，各因子编码值试验设计方案和试验结果见表1和表2。按其选择的因素和水平进行回流提取，测定马钱子碱和士的宁含有量。

表1 Box-Behnken 试验设计因素与水平编码Tab.1 Factors and the levels of coding for Box-Behnken experimental design

表2 Box-Behnken 设计与试验结果Tab.2 Box-Behnken design and test result

2.3.2 模型拟合 将所得数据用Design-Expert V.8.0.6 软件进行效应面试验分析。综合考虑马钱子碱和士的宁的药效和毒性［6］，以马钱子碱含有量的40%、士的宁含有量的60%为综合效应值，分别对各因素进行多元线性回归和二次多项回归模型拟合，得综合效应= -39.838 76 +3.654 03 ×液料比+1.932 28 ×乙醇体积分数-25.473 74 ×提取时间- 0.021 919 × 液料比× 乙醇体积分数+1.535 83液料比× 提取时间- 0.159 20 × (液料比)2-0.020 380 × (乙醇体积分数)2-2.379 57 ×(提取时间)2，该方程的相关系数r =0.971 2 表明该回归模型的拟合情况良好，回归方程的代表性较好，能准确地预测实际情况。由表3 可知整体模型达到显著水平(P ＜0.05)，表明该二次方程模型比较显著，失拟项不显著(P =0.058 8)，该方程对试验拟合较好，可以对不同条件下的马钱子碱和士的宁碱提取量进行预测。

2.3.3 响应面分析与优化

2.3.3.1 二次回归模型的建立及显著性检验，见表3。

表3 方差分析Tab.3 ANOVA

2.3.3.2 提取工艺的响应面分析与优化 采用Design-Expert V.8.0.6 软件，根据回归方程分析结果，作出综合效应随因素变化的效应面图，如图2 ～图4 所示。结果预测最佳提取工艺条件为乙醇体积分数55%，液料比为14 ∶1，提取时间2 h。

图2 乙醇体积分数和液料比对综合效应的影响Fig.2 Effects of ethanol content and liquid-to-soild ratio on comprehensive effect

图3 提取时间和乙醇体积分数对综合效应的影响Fig.3 Effects of extraction time and ethanol content on comprehensive effect

图4 提取时间和液料比对综合效应的影响Fig.4 Effects on extrection time and liquid-tosoild ratio on comprehensive effect

2.4 验证试验 按优选的提取工艺进行3 次验证试验，结果综合效应值分别为25.501 2、24.910 5、25.012 8，RSD 为1.2%，说明该模型预测较好，得到的拟合方程可较好地描述因素与指标的关系。

2.5 Box-Behnken 响应面法与正交设计优化马钱子提取工艺的比较 正交设计实验结果如表4 所示。由正交实验结果所得最佳的提取工艺条件为乙醇体积分数60%，液料比14 ∶1，回流提取2 h。正交设计所优选出的马钱子提取工艺马钱子碱和士的宁的得率分别为17.693 2、24.068 1 mg/g。采用Box-Behnken 响应面法优选出的马钱子提取工艺马钱子碱和士的宁的得率分别为22.140 8、27.142 0 mg/g。说明Box-Behnken 响应面法优化的马钱子提取工艺马钱子碱和士的宁的得率更高，工艺更可行。

表4 正交设计与试验结果Tab.4 Orthogonal design and test result

3 讨论

目前用于中药材的提取溶剂主要有水、乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷等［14］。汤淮波等［15］采用不同的提取溶剂提取马钱子并测定士的宁和马钱子碱的含有量，发现水提与醇提和三氯甲烷提士的宁和马钱子碱的含有量存在较大差异，醇提与三氯甲烷提士的宁和马钱子碱的含有量没有显著差异。马钱子为种子类药物，含有大量的淀粉，油脂，且种子上密被细密的绒毛。水提取时提取液混浊，提取液中水溶性杂质量多;有机溶剂提取时，脂溶性成分含有量较多，生物碱不易分离;酸性乙醇水提取时，生物碱盐既能溶于水又能溶于乙醇，士的宁和马钱子碱在提取过程中可能以盐的形式存在，故提取率较高;且用乙醇水作为提取溶剂，对环境污染小，成本较低。本实验采用了Box-Behnken 响应面法进行拟合，充分考虑了各因素之间的相互作用，得到了明确的回归方程，通过方差分析来预测结果，提高了实验的预测性和准确性，且经过验证试验表明该方法合理稳定，用于优化马钱子提取工艺是可行的。

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