KBT-ZTC澄清剂用于补肾温肺合剂水提液的澄清工艺研究

2015-01-13冯传平

中成药 2015年5期

关键词：水提液藿苷甲苷

冯传平，杨惠，李辉，陈斌

（湖南中医药高等专科学校，湖南株洲412012）

KBT-ZTC澄清剂用于补肾温肺合剂水提液的澄清工艺研究

冯传平，杨惠，李辉，陈斌

（湖南中医药高等专科学校，湖南株洲412012）

目的筛选KBT-ZTC澄清剂用于补肾温肺合剂提取液的最佳纯化澄清工艺。方法以黄芪甲苷、淫羊藿苷保留率和固形物去除率为指标，通过单因素实验考察水提液浓度、加入KBT-ZTC时的温度、顺序及其用量、保温时间和搅拌对纯化除去杂质效果的影响。应用正交设计方法筛选优化工艺条件。结果水提液浓度1∶7，搅拌速度为100 r/min，温度50℃，操作时先加3%B组分，然后加0.15%A组分。结论KBT-ZTC澄清剂可用于补肾温肺合剂水提液的纯化除杂。

补肾温肺合剂；KBT-ZTC澄清剂；澄清工艺

补肾温肺合剂是由黄芪、淫羊藿等十味中药组成，课题组完成了大量的制剂工艺筛选研究［1-3］。该制剂为我校附属第一医院院内制剂，临床主要用于支气管哮喘、过敏性鼻炎等疾病［4］。补肾温肺合剂的原生产工艺中对水提液部分采用水提醇沉法除杂，这样需要耗费大量酒精，成本较高，且醇沉后有效成分损失较大。为了降低生产成本，改善产品的澄明度，并提高产品的质量，在参考了文献的基础上［5-10］，本实验采用KBT-ZTC澄清剂对其水提液纯化工艺进行了研究，并且比较了天然澄清剂法与传统的醇沉法的除杂效果。

1 材料

1.1 药品与试剂淫羊藿、黄芪等药材均购于湖南三湘中药饮片有限公司，经我校生药教研室李飞艳副教授鉴定，均符合《中国药典》2010年版标准。KBT-ZTC澄清剂A、B（上海科立尔生物技术公司），所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器 Agilent高效液相色谱仪；Alltech2000型蒸发光散射检测器；METTLER-AE240型电子分析天平，黄芪甲苷对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号110781-200613），淫羊藿苷对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号110737-200415）。

2 方法与结果

2.1 样品溶液的制备

2.1.1 提取液的制备称取本药配方药物9份，其中防风等提取挥发油后（挥发油备用）的药渣与其他药味按加水量为药材总量的10倍，煎煮时间为1.5 h，煎煮次数为3次方法进行提取，然后浓缩，静置沉淀，过滤，滤液浓缩至含生药量分别为为1∶5、1∶7、1∶10，静置沉淀，过滤，得滤液备用，量取100 ML，进一步浓缩至10 mL，以测定溶液中淫羊藿苷、黄芪甲苷的含有量。

2.1.2 纯化除杂后样品液的制备取各澄清纯化除杂后的溶液，过滤，量取100 mL，进一步浓缩至10 mL，以测定溶液中淫羊藿苷、黄芪甲苷的含有量。

2.2 澄清剂溶液的配制

2.2.1 5%A组分溶液的配制取1份中药澄清剂A组分，用纯净水溶解稀释成20份，搅拌溶解均匀。

2.2.2 5%B组分溶液的配制取1份B组分用纯净水分散稀释成20份，搅拌充分分散，放置2～3 h，再搅拌混匀1次。

2.3 评价衡量指标

2.3.1 淫羊藿苷保留率保留率=澄清纯化后的淫羊藿苷含有量/澄清纯化前的淫羊藿苷含有量×100%。

2.3.2 黄芪甲苷保留率保留率=澄清纯化后的黄芪甲苷含有量/澄清纯化前的黄芪甲苷含有量×100%。

2.3.3 固形物去除率固形物去除率=（澄清纯化前固形物质量-澄清纯化后固形物质量）/澄清纯化前固形物质量×100%。具体操作如下：取蒸发皿干燥至恒定质量，将澄清纯化处理前后的提取液各100 mL置于其中并水浴蒸干，105℃条件下烘3 h后，在干燥器中令其冷却，于30 min后精密称定质量。

2.3.4 综合评分考虑到最大限度地保留有效成分，同时又能有较好的澄清效果，本实验采取综合评价指标：固形物去除率（Y1）的权重定为0.2，黄芪甲苷保留率（Y2）和淫羊藿苷保留率（Y3）的权重各定为0.4，综合评分：OD%=（Y1/Y1max×0.2+Y2/Y2max×0.4+Y3/Y3max×0.4）×100%。2.4 淫羊藿苷的定量测定［11-13］

2.4.1 色谱条件参数色谱柱Zorbax SB-C18（4.6 mm× 250 mm，5μm）；流动相组成为乙腈-水（32∶68）；波长270 nm；进样体积15μL；柱温室温；流动相体积流量0.80 mL/min。

2.4.2 对照品溶液精密称取适量淫羊藿苷对照品，加甲醇溶解制成质量浓度为0.093 8 mg/mL的淫羊藿苷对照品溶液。

2.4.3 供试品溶液精密吸取样品10 mL置量瓶中，加15 mL甲醇溶解，超声20 min，滤过，滤液置于50 mL量瓶中，加甲醇定容，微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。2.4.4 空白溶液取缺淫羊藿药材的制剂，按 “2.4.3”项下制法制备。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图

2.5 黄芪甲苷的定量测定［14-15］

2.5.1 色谱条件参数 ZORBAX C18色谱柱（4.6mm×150 mm，5μm）；柱温为常温；流动相组成为甲醇-水（75∶25）；流动相体积流量0.8 mL/min；气体体积流量2.5 mL/min；漂移管温度80℃。

2.5.2 对照品溶液精密称取适量黄芪甲苷对照品，置量瓶中，加甲醇溶解制成质量浓度为98.88μg/mL的黄芪甲苷对照品溶液。

2.5.3 供试品溶液精密量取样品适量（约10 mL），加纯化水10 mL稀释，用三氯甲烷15 mL振摇萃取，共萃取3次，收集水层，用水饱和正丁醇15mL振摇萃取，共萃取4次，收集合并正丁醇液，再用0.5%氢氧化钠溶液10mL洗涤，共洗涤2次，然后再用正丁醇饱和水10 mL洗涤，共洗涤2次，水浴蒸干合并的正丁醇液后，用75%甲醇溶解残渣，10mL量瓶定容，摇匀后，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，即得。

2.5.4 空白溶液取缺黄芪药材的制剂，按 “2.5.3”项下制法制备。色谱见图2。

图2 高效液相色谱图

2.6 单因素考察澄清剂除杂工艺

2.6.1 加入KBT-ZTC两组分顺序对纯化除杂效果的影响

按说明书的要求及注意事项操作，结合本实验需处理的提取液pH情况，确定KBT-ZTC澄清剂在实验中的加入顺序为先B组分后A组分，且比例为2∶1。

2.6.2 澄清剂用量对纯化除杂效果的影响取含生药量浓度为1∶7的提取液各100 mL，先按百分体积用量分别为2%、3%、4%、5%、6%加入KBT-ZTC澄清剂B组分，在50℃条件下搅拌10min，再保温20min，然后按百分体积用量分别为1%、1.5%、2%、2.5%、3%加入KBT-ZTC澄清剂A组分，在50℃条件下搅拌10min，再保温20 min，过夜静置24 h后滤过，滤液定容至100 mL，测定固形物去除率、黄芪甲苷和淫羊藿苷保留率，结果表明KBT-ZTC用量对澄清效果影响明显，固形物去除率随着KBT-ZTC用量增加同时也增大，而黄芪甲苷、淫羊藿苷保留率则随之下降。

2.6.3 水提液浓度、操作温度、保温时间、搅拌速度及持续时间对纯化除杂效果的影响取含生药量浓度为1∶7的水提液进行单因素试验，其中B/A组分用量分别为3%和 1.5%，其他操作参照 “2.6.2”项下方法。结果表明水提液浓度、搅拌速度对纯化除杂效果影响较大，而搅拌持续时间及保温时间影响较小，因此，保温10 min，搅拌持续10 min，就可达到满意的纯化除杂效果。

2.7 正交设计筛选除杂工艺条件根据上述实验结果，选择澄清剂B/A组分加入量、水提液浓度、搅拌速度3个因素作为考察因素，以固形物保留率及黄芪甲苷、淫羊藿苷的含有量作为综合评价指标，按L9（34）正交表安排试验方案。取生药量为1∶7的浓缩液100 ML，加5%B组分，搅拌，混合均匀（50℃保温）10 min，静置20 min（50℃保温），再加5%A组分，混合均匀（50℃保温）10 Min，静置20 min（50℃保温），观察。因素水平见表1，实验结果见表2，方差分析结果见表3。

表1 正交实验因素水平

表2正交实验及结果

表3方差分析结果

由表2可知，各因素对KBT-ZTC澄清剂的纯化除杂效果影响大小依次为A＞B＞C，即水提液浓度＞KBT-ZTC澄清剂加入量＞搅拌速度。由直观分析最佳方案为A2B2C2。方差分析显示A、B因素对纯化除杂效果影响有显著性差异，C因素无显著性差异（见表3）；考虑到搅拌速度的便利性并结合单因素试验优选出KBT-ZTC的澄清纯化最佳工艺条件为A2B2C1，验证试验结果见表4。

表4验证试验（n=3）

表4说明该澄清纯化工艺条件稳定、可行。因此，确定最佳工艺条件为A2B2C1，即取生药量浓度为1∶7的提取液，在50℃条件下先滴加3%的B组分，100 r/min搅拌10 min，然后50℃条件下水浴保温20 min；再滴加1.5%的A组分，100 r/min搅拌10 min，50℃条件下水浴保温20min；过夜静置24 h，滤过，即得。

2.8 不同工艺的纯化效果比较量取100 mL生药量浓度1∶7的水提液，加入乙醇，分3次加入，边加边搅拌，使含醇量达到55%，过夜静置24 h，过滤，然后浓缩至无醇味，再用纯化水定容至100 mL，制备得水醇法样品。另取100 mL生药量浓度1∶7的水提液，在50℃下先加入KBTZTC澄清剂B组分3%，搅拌10 min，50℃水浴保温20 min；再加入A组分1.5%，搅拌10 min，50℃水浴保温20 min；过夜静置24 h，滤过，100mL量瓶定容，制备得澄清法样品。再取100 mL的1∶7的水提液，作为水提液原液，以上3种样品按样品测定方法进行处理，分别测定浸膏得率、固形物去除率、淫羊藿苷、黄芪甲苷，结果见表5。

表5 不同工艺的纯化效果比较（n=3）

由表5可知，水醇法处理后，固形物去除率为24.25%，而淫羊藿苷保留率和黄芪甲苷保留率分别为43.56%和47.65%；经澄清剂处理后固形物去除率为22.42%，而淫羊藿苷保留率和黄芪甲苷保留率分别为85.54%和86.35%，说明水醇法和澄清法在沉淀除杂方面差异不大，但水醇法对有效成分吸附多，导致损失较多，结果表明澄清剂法效果优。

3 讨论

絮凝澄清法是在混悬的中药提取液中加入絮凝剂（澄清剂），通过电中和、吸附架桥、网捕和卷扫作用，使体系中悬浮物及胶体粒子絮凝沉淀，以达到分离纯化的一种方法。传统的水提醇沉法对有效成分损失率极高，而KBTZTC絮凝澄清剂既能极大程度地保留有效成分又能澄清药液，达到除杂目的。

醇沉法在制药工业上较为常用，大量的亲水杂质如淀粉、蛋白质杂质均可沉淀，但有效成分的损失也较大。此外，经醇沉后药液的黏性较大，浓缩较难，生产周期较长，导致成本增高。而澄清法有效成分损失少，易于浓缩，工艺简单、且成本低。本实验通过采用澄清法纯化补肾温肺合剂水提液并与醇沉法比较，研究表明：在固形物保留率上两者无明显差别，而两种有效成分淫羊藿苷保留率和黄芪甲苷保留率明显高于醇沉法。因此，KBT-ZTC澄清剂可用于补肾温肺合剂水提液的纯化除杂。

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