一测多评法测定中成药中洋川芎内酯A和藁本内酯

杨 艳， 易进海， 刘云华， 黄志芳， 刘玉红， 陈 燕

（1.四川省中医药科学院，四川成都610041；2.泸州医学院，四川泸州646000）

一测多评法测定中成药中洋川芎内酯A和藁本内酯

杨 艳1，2， 易进海1*， 刘云华1， 黄志芳1， 刘玉红1， 陈 燕1

（1.四川省中医药科学院，四川成都610041；2.泸州医学院，四川泸州646000）

目的以丁苯酞为内标一测多评法测定都梁滴丸、白带丸、血府逐瘀胶囊中洋川芎内酯A和藁本内酯。方法

都梁滴丸；白带丸；血府逐瘀胶囊；相对校正因子；洋川芎内酯A；藁本内酯；丁苯酞；一测多评

川芎、当归在中成药中广泛应用，二者的化学成分和功效有相似之处，其挥发油成分为苯酞类衍生物，与川芎、当归的功能主治密切相关，主要代表性有效成分为藁本内酯（ligustilide）和洋川芎内酯A（senkyunolide A）［1-3］，故应测定该类成分的含有量以便客观评价和控制中成药的质量。目前文献报道均是以洋川芎内酯A和藁本内酯为对照品，采用外标法测其二者的含有量［4-6］；但洋川芎内酯A和藁本内酯稳定性差，不宜作为法定的含量测定用对照品。本课题组前期报道了以稳定的丁苯酞作为替代对照品，采用双波长检测，同时测定川芎中丁苯酞和藁本内酯的量，但丁苯酞的含有量很低［7］。本实验以含川芎和/或当归的都梁滴丸、白带丸和血府逐瘀胶囊为代表性药物，进一步改进分析方法，以丁苯酞为内标，采用单波长检测，“一测多评”法测定主要有效成分洋川芎内酯A和藁本内酯的量，并与外标法测定结果进行比较，结果表明该方法简便适用可行，为中成药中川芎、当归的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

Agilent1200高效液相色谱系统；Waters1525-2487高效液相色谱系统，Breeze液相色谱工作站；Agilent1100高效液相色谱系统；Agilent Eclipse XDB-C18（4.6mm×150mm，5μm），Phenomenex Luna C18（4.6 mm×150 mm，5μm），Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5μm），岛津AUX220型万分之一电子天平，岛津AUW220D型十万分之一电子天平，KQ-300B型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。

丁苯酞对照品 （批号101035-200901）购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用，洋川芎内酯A和藁本内酯对照品由本实验室自制，经核磁共振波谱法［8-9］测定其纯度分别为 90.61%和92.80%。都梁滴丸样品 （批号分别为 140403，131004，120702）为市售品 （北京九龙制药有限公司），白带丸样品 （批号分别为 1401083，130118，130606）为市售品 （河北万岁药业有限公司），血府逐瘀胶囊样品 （批号分别为C03033，D03041，C03208）为市售品 （天津宏仁堂药业有限公司）。甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 测定波长的选择 取丁苯酞、洋川芎内酯A和藳本内酯对照品，在200～400 nm范围内扫描，测得其紫外吸收光谱见图1。由图1可见，丁苯酞、洋川芎内酯A和藁本内酯三者在波长280 nm处均有较大吸收，故采用280 nm单波长检测测定。

图1 丁苯酞 （A）、洋川芎内酯A（B）和藁本内酯 （C）的紫外吸收图谱Fig.1 UV spectruMof butylphthalide（A），senkyunolide A（B）and ligustilide（C）

2.2 色谱条件 Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5μm）；流动相为甲醇-水（52∶48）；体积流量为1.0 mL/min；柱温为35℃；进样量10μL；检测波长280 nm。上述色谱条件下，各成分分离良好，阴性样品无干扰，结果见图2。

2.3 混合对照品溶液的制备 称取对照品丁苯酞、藁本内酯和洋川芎内酯A适量，精密称定，加无水乙醇分别制成每1 mL含丁苯酞1.994 mg，藁本内酯0.806 7 mg，洋川芎内酯A 0.434 6 mg的溶液，作为贮备液。分别精密量取上述对照品贮备溶液各1 mL，置同一10 mL棕色量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液 （每1 mL含丁苯酞199.4μg，含藁本内酯80.67μg，含洋川芎内酯A 43.46μg）。

2.4 供试品溶液的制备 都梁滴丸、白带丸粉碎过三号筛，取二者粉末和血府逐瘀胶囊内容物约1～1.5 g，精密称定，分别置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 ML，称定质量，超声处理（100 W，40 kHz）40 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，置棕色瓶中，即得供试品溶液。

2.5 阴性样品溶液的制备 按照都梁滴丸、白带丸和血府逐瘀胶囊的处方和制法，制成不含川芎、当归的阴性样品，并按供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。

图2 混合对照品 （A）、都梁滴丸 （B）、都梁滴丸阴性 （C）、白带丸 （D）、白带丸阴性 （E）、血府逐瘀胶囊（F）及血府逐瘀胶囊阴性（G）HPLC图Fig.2 HPLC chromatograMs ofMixture reterence substances（A），Duliang Dropping Pills（B），negative saMp le of Duliang Dropping Pills（C），Baidai Pills（D），negative saMp le of Baidai Pills（E），Xuefu Zhuyu Capsules（F）and negative saMp le of Xuefu Zhuyu Capsu les（G）

2.6 方法学考察

2.6.1 线性关系考察、检测限和定量限测定 精密吸取上述混合对照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，按 “2.2”项下方法分别测定丁苯酞、洋川芎内酯A和藁本内酯的峰面积，重复3次，取平均值。以进样量X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，结果见表1。当信噪比 （S/N）为3时的被测物质量为检测限，信噪比 （S/N）为10时的被测质量为定量限，据此测得丁苯酞、洋川芎内酯A和藁本内酯的检测限和定量限见表1。

表1 3个成分的标准曲线、检测限和定量限Tab.1 L iner correlation，liMit of detection and liMit of quantitation of three coMponents

2.6.2 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，按 “2.2”项下方法连续进样6次，记录峰面积，洋川芎内酯A和藁本内酯峰面积的RSD均为0.1%，表明仪器精密度良好。

2.6.3 稳定性试验 取同一供试品溶液，室温下放置，分别在0、2、4、6、8、24 h进样测定峰面积，洋川芎内酯A和藁本内酯峰面积的RSD均为1.8%，表明供试品溶液在24 h内测定，结果稳定。

2.6.4 重复性试验 取都梁滴丸粉末 （批号140403）1 g，精密称定，共6份，按 “2.4”项下方法制备样品，测定，洋川芎内酯A和藁本内酯的平均含有量分别为0.069 3%和0.067 8%，RSD分别为0.6%和1.8%。表明该方法的重复性良好。2.6.5 加样回收试验 取都梁滴丸粉末 （批号140403）0.5 g，精密称定，共6份，分别精密加入含洋川芎内酯A（0.3520 mg/mL）和藁本内酯（0.339 0 mg/mL）的对照品溶液各1 mL，按“2.4”项下方法制备样品，测定并计算加样回收率，洋川芎内酯A和藁本内酯的平均回收率分别为99.7%和100.0%，RSD分别为1.2%和1.5%。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=6）Tab.2 Result of recovery tests（n=6）

2.6.6 相对校正因子的测定 以丁苯酞作为内标物，按照公式相对校正因子 （f）=（Ai×Cr）/（Ar×Ci）［7］（Ai为替代对照品的峰面积；Ar为真实对照品的峰面积；Ci为替代对照品的浓度；Cr为真实对照品的浓度），计算6个不同进样量时洋川芎内酯A对丁苯酞的校正因子f1和藁本内酯对丁苯酞的校正因子f2的平均值。结果见表3。

2.6.7 校正因子的重现性考察 采用Agilent E-clipse XDB-C18色谱柱，分别考察了Agilent1200、Agilent1100和Waters1525-2487液相色谱系统；采用Agilent1200液相色谱仪，考察了3种不同型号的色谱柱（Agilent Eclipse XDB-C18、Phenomenex Luna C18、Agilent Zorbax SB-C18）；采用Agilent1200、Agilent Eclipse XDB-C18柱分别考察了不同柱温 （25℃、30℃、35℃）、不同仪器体积流量（0.9、1.0、1.1 mL/min）对校正因子的影响，结果见表4，表明相对校正因子的重现性良好（RSD＜2%）。

表3 相对校正因子计算结果 （n=3）Tab.3 Result of the relative correction factors

表4 相对校正因子重现性考察结果 （n=3）Tab.4 Reproducibility of relative correction factors（n=3）

2.6.8 待测组分色谱峰的定位 经研究发现，只使用丁苯酞作为对照品时，引入两组分的相对保留时间值并结合色谱峰的紫外吸收光谱特征可以作为定位藁本内酯峰和洋川芎内酯A峰的标准。本实验考察了在不同品牌仪器和不同规格色谱柱中的重复性，得到洋川芎内酯A对丁苯酞的相对保留时间的平均值为0.91，藁本内酯对丁苯酞的相对保留时间的平均值为1.64，RSD分别为0.4%和1.3% （n=6）。表明不同品牌色谱仪和不同规格的色谱柱对相对保留时间值的影响不大，因此，可以根据相对保留时间值来定位藁本内酯峰和洋川芎内酯A色谱峰。

2.7 一测多评法与外标法测定结果的比较 本实验以外标法和一测多评法分别测定3批都梁滴丸、白带丸、血府逐瘀胶囊中洋川芎内酯A和藁本内酯的含量，结果见表5。表明一测多评法计算值与外标法实测值之间没有明显差异，说明建立的相对校正因子具有很好的重现性和可信度，在定量用对照品缺乏情况下，可以通过一测多评法实现对都梁滴丸、白带丸和血府逐瘀胶囊中洋川芎内酯A和藁本内酯含有量的同步测定。

表5 两种方法测得中成药中洋川芎内酯A和藁本内酯结果比较（%，n=3）Tab.5 CoMparision of contents of ligustilide and senkyunolide A in Chinese patent medicines by two methods（%，n=3）

3 讨论

采用 “一测多评”法进行多成分的质量评价，各成分相对校正因子的确定和待测成分色谱峰的定位很重要。本实验考察了影响相对校正因子重现性的仪器、色谱柱、柱温和体积流量，结果表明相对校正因子具有较好的可靠性。在进行待测成分色谱峰定位时，分别对保留时间和相对保留值进行了考察，表明相对保留值重现性较好，RSD小于5%，因此采用相对保留值作为定位待测成分色谱峰的依据。此外，还可以与川芎、当归对照药材的色谱峰进行比对，以及进一步验证待测成分的紫外吸收光谱，确保色谱峰定位准确可靠。

都梁滴丸由川芎、白芷组成，血府逐瘀胶囊由川芎、当归等十一味中药组成，白带丸由当归等五味中药组成。都梁滴丸和血府逐瘀胶囊能同时检测出洋川芎内酯A和藁本内酯，而白带丸仅检测出藁本内酯，与文献报道当归不含洋川芎内酯A相符［8-9］。本实验采用法定对照品丁苯酞为内标，同时测定中成药中洋川芎内酯A和藁本内酯的量，该方法简便适用可行，解决了对照品不稳定的难题。

洋川芎内酯A和藁本内酯对照品不稳定，制备后应立即使用或置-20℃短期保存，临用时应重新标定其含量。由于二者稳定性差，为油状物质，在制备过程中常残留部分溶剂或降解产物，HPLC峰面积归一化法测得的纯度往往偏高，因此，本实验采用核磁共振波谱法［10-11］测得洋川芎内酯A、藁本内酯对照品的绝对含有量分别为90.61%和92.80%，进行相对校正因子测定，保证测定结果的准确可靠。

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DeterMination of senkyunolide A and ligustilide in Chinese tranditional patent medicines by QAMS

YANG Yan1，2， YI Jin-hai1*， LIU Yun-hua1， HUANG Zhi-fang1， LIU Yu-hong1， CHEN Yan1
（1.Sichuan Provincial Academy of Chinese Medicine Sciences，Chengdu 610041，China；2.Luzhou Medical College，Luzhou 646000，China）

AIMTo take butylphalide as the internal reference standard to establish an HPLCmethod for simultaneously determining senkyunolide A and ligustilide in Duliang Dropping Pills，Baidai Pills and Xuefu Zhuyu Capsules using quantitative analysis ofmulti-components by singlemarker（QAMS）.METHODSThe analyses ofmethanolic extracts of above pills and capsules were performed on Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5μm）column with methanol-water（52∶48）asmobile phase，the relative correction factors of ligustilide and senkyunolide A weremeasured and their reproducibility examined under different conditions，and the comparison wasmade with external standardmethod.RESULTSThe contents of senkyunolide A and ligustilide in Duliang Dropping Pills and Xuefu Zhuyu Capsuleswere found，only ligustilide in Baidai Pillswas detected.The relative correction factors presented good reproducibility on Agilent Eclipse XDB-C18，Phenomenex Luna C18and Agilent Zorbax SB-C18columns.There was no significant difference between QAMS and external standard method.CONCLUSIONThe adopted QAMS can be applied to the quality control of Chuanxiong Rhzoma and Angelicae sinensis Radix in aid of solving the instability of senkyunolide A and ligustilide.

Duliang Dropping Pills；Baidai Pills；Xuefu Zhuyu Capsules；relative correction factor；senkyunolide A；ligustilide；butylphalide；quantitative analysis ofmulti-components by single marker（QAMS）

R927.2

：A

：1001-1528（2015）05-1000-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.016

2014-10-19

2015年版中国药典科研计划；中国科学院重点部署项目 （KSZD-EW-Z-004）

杨 艳（1990—），女，硕士，研究方向为中药化学成分与质量标准。E-mail：154984840@qq.com

*通信作者：易进海（1963—），男，研究员，研究方向为中药化学成分与质量评价。Tel： （028）85210843，E-mail：yijinhai63@ 163.com

待测药物以甲醇提取，HPLC分析采用的色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150mm，5μm），流动相为甲醇-水 （52∶48）。测定洋川芎内酯A和藁本内酯的相对校正因子，考察其校正因子的重现性，并与外标法进行比较。结果都梁滴丸和血府逐瘀胶囊能同时检测出洋川芎内酯A和藁本内酯，而白带丸仅检测出藁本内酯。在Agilent E-clipse XDB-C18、Phenomenex Luna C18和Agilent Zorbax SB-C18色谱柱上测定的相对校正因子重现性好，与外标法实测值无显著差异。结论本法可用于川芎、当归的质量控制，解决了洋川芎内酯A和藁本内酯对照品不稳定的难题。