心肌缺血再灌注损伤中TNF-α血清水平表达对心肌收缩功能影响的实验研究

郑俊华，唐浩然，景丽英，罗琼珍

心肌缺血再灌注损伤中TNF-α血清水平表达对心肌收缩功能影响的实验研究

郑俊华，唐浩然，景丽英，罗琼珍

目的 探讨心肌缺血再灌注损伤中肿瘤坏死因子α(TNF-α)血清水平表达对心肌收缩功能的影响。方法 用健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠制作心肌缺血再灌注损伤模型。连接BioLab-410型生物信号采集和处理系统，记录心电图，测定并记录心肌缺血前、缺血30 min及再灌注30 min、60 min、90 min、120 min各个时相点血清中TNF-α水平和平均动脉压(MAP)、心肌收缩功能，分析TNF-α水平与心肌收缩功能相关性。结果 冠状动脉结扎后30 min，大鼠血清中TNF-α较缺血前明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)，再灌注后较缺血前、缺血30 min显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)，再灌注后维持在较高水平。冠状动脉结扎30 min后，MAP、心率(HR)、左室收缩末压(LVSP)、左室内压最大变化速率(±dp/dtmax)明显降低，左室舒张末压(LVEDP)明显增高，与缺血前比较差异有统计学意义(P<0.05)；与缺血前、缺血30 min比较，再灌注后MAP、HR、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax显著降低，LEVDP显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 心肌缺血再灌注损伤中血清TNF-α水平的表达与心肌收缩功能出现平行的同向变化趋势，具有明显的相关性，TNF-α血清水平升高会抑制心肌收缩功能。

心肌缺血；再灌注损伤；肿瘤坏死因子；心肌收缩功能

心脏缺血性疾病的发病率和致死率在世界范围内呈增长趋势[1]，严重危害人类健康。心肌持续性缺血可导致组织损伤和细胞死亡。心肌缺血最有效的治疗措施是恢复血液供应，缺血后恢复血流供应的过程称为再灌注，尽管早期再灌注对组织非常重要，但再灌注可使缺血心肌损伤加重，即产生心肌缺血再灌注损伤(ischermic reperfusion injury，IRI)[2，3]。研究发现炎症细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)在心肌缺血再灌注损伤过程中发挥了重要作用[4]。近年来，肿瘤坏死因子与缺血再灌注损伤的关系以及抗肿瘤坏死因子治疗日益受到重视。研究结果显示，有效降低TNF-α水平，可增加射血分数，减少缺血再灌注心脏发生新功能不全延缓心室重塑、减少心肌细胞凋亡及降低死亡率[5]。本实验采用大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，观察血清中TNF-α表达水平对心肌收缩功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁(clean，CL)级健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠57只，年龄12周，体重250 g～300 g，购于南方医科大学实验动物中心，许可证：SCXK(粤)2006-0015。

1.2 仪器 TKB-200C型小动物呼吸机(江苏省特力麻醉呼吸设备公司)；DT-8836红外线体温加热器(深圳市杰能宝智能科技有限公司)；BioLab-410型生物信号采集和处理系统(成都泰盟科技有限公司)；U型水银压力计(自制)；电子天平。

1.3 药品与试剂 3%戊巴比妥钠；TNF-α ELLSA检测试剂盒(上海依科赛有限公司)。

1.4大鼠活体心肌缺血再灌注损伤模型建立

1.4.1 参照文献[6]的方法改良进行建模 大鼠均用3%戊巴比妥钠1 mL/kg腹腔注射麻醉，为控制呼吸道分泌物，术前给予阿托品。连接生物机能实验系统，记录心电图。待SD大鼠麻醉后，常规去毛，消毒皮肤，剪皮，钝性分离并暴露气管，切开立即用24G×0.75、0.7mm×1.9mm规格的静：脉留置针前软管(1.5 mm×2.0 mm)行气管插管，连接小动物呼吸机辅助呼吸，调节潮气量维持在1 mL/100 g～1.5 mL/100 g，呼吸次数80次/min～100次/min，I∶E=1∶2，压力在5 cmH2O～15 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)之间，根据呼吸频率及强度调整呼吸参数。采用红外线体温加热器维持体温在36.5 ℃～37.0 ℃。开胸手术：大鼠采用右侧卧位，暴露左侧腋窝，从左腋窝下缘做横行切口至左胸骨旁剪开皮肤，距离胸骨中线约2 mm，整个横行切口大约8 mm。逐层分离，剪断胸大小肌，暴露胸壁肋间隙，在第3～5肋间隙钝性分离肋间肌，进入胸腔。采用自制拉钩，以四角撑开肋间隙暴露范围6 mm～8 mm，剥离心包膜充分显露左心耳及左心室。在左心耳与肺动脉圆锥之间，找到于心肌内与心大静脉走向一致的冠状动脉左前降支，在左心耳根部1 mm～2 mm处，以3/8号带线缝合针穿线结扎左冠状动脉，结

扎线下置双股2号线作松解用。阻断左冠状动脉30 min，再灌注，造成心肌缺血再灌注损伤模型。动物模型成功标准：结扎左冠状动脉前降支，肉眼观心脏左室壁出现变暗变紫，心电图显示ST段弓背向上抬高(>0.25 mV)，QRS波增宽；30 min后，松开活结再灌注，可观察到缺血区心肌慢慢变红色，发绀区变小，心电图ST段逐渐下降[7]。

1.4.2 平均动脉血压和心肌收缩功能 左侧股动脉插管，连接三通和U型水银血压计，用于记录平均动脉血压(MAP)，右侧颈总动脉插管至左心室，连接BioLab-410型生物信号采集和处理系统测定心率(HR)、左室收缩末压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)和左室内压最大变化速率(±dp/dtmax)。记录心肌缺血前、缺血后30 min和再灌注后30 min、60 min、90 min和120 min不同时相点的平均动脉血压和心肌收缩功能变化。

1.4.3 血清中TNF-α水平测定 采集心肌缺血前、缺血后30 min和再灌注后30 min、60 min、90 min和120 min不同时相点动脉血。均经腹主动脉快速抽取动物血3.0 mL～4.0 mL，以3 000 r/min离心15 min，分离出血清，置于-20 ℃冰箱内保存，按ELLSA检测试剂盒说明书进行操作。

1.5 统计学处理 计量资料采用配对t检验或单因素随机区组方差分析。采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 实验动物分析 实验所用SD大鼠57只，造模死亡6只，主要是因为结扎时大出血死亡1只，麻醉意外死亡1只，结扎左冠状动脉前降支后心律失常死亡2只，再灌注后心律失常死亡2只。

2.2 平均动脉血压和心肌收缩功能变化 冠状动脉结扎30 min后，MAP、HR、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax明显降低，LEVDP明显增高，与缺血前比较差异具有统计学意义(P<0.05)；与缺血前比较，再灌注后MAP、HR、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax显著降低，LEVDP显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)；再灌注后比缺血30 min时MAP、HR、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax明显下降，LEVDP明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)，且再灌注后MAP、HR、LVSP、及+dp/dtmax、-dp/dtmax在30 min时最低，60 min及以后均有所上升，LEVDP在30 min时最高，60 min后有所降低，但仍维持较高水平。详见表1。

表1 缺血前后及再灌注后各个时相点MAP和心肌收缩功能的比较(±s)

2.3 血清中TNF-α水平测定结果 冠状动脉结扎后30 min，大鼠血清中TNF-α明显增高，与缺血前比较差异有统计学意义(P<0.05)；再灌注后比缺血前、缺血30 min显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)，并且可见TNF-α再灌注30 min时含量最高，达到峰值，而在再灌注60 min呈现轻度下降，但在90 min～120 min仍维持较高水平。详见表2。

表2 缺血前后及再灌注后各个时相点

2.4 血清中TNF-α水平与平均动脉压和心肌收缩功能的相关性分析 表1结果显示，缺血前、缺血后及再灌注各个时相点平均动脉压和心肌收缩功能的变化基本一致。对比表1和表2，可见血清中TNF-α水平与心肌收缩功能出现平行的同向变化趋势，经统计处理显示两者间存在显著相关性。缺血30 min时，TNF-α明显高于缺血前，心肌收缩功能较缺血前明显降低；再灌注30 min时，TNF-α显著高于缺血前、缺血30 min，心肌收缩功能较缺血前、缺血30 min显著降低，并且此时TNF-α峰值最大，同时心肌收缩功能峰值最小；随着再灌注进行到60 min、90 min和120 min时相点，TNF-α略低于再灌注30 min，但是仍然维持在较高水平，同时在60 min、90 min和120 min时相点时，心肌收缩功能相对于再灌注30 min有所上升，但是整体水平仍然保持在较低水平。随着TNF-α逐渐上升心肌收缩功能逐渐下降。

3 讨 论

心肌缺血再灌注损伤是临床心绞痛、急性心肌梗死(AMI)早期再灌注、经皮穿刺冠状动脉腔内成形术及心脏移植术后等心功能不全和心律失常的主要病理基础[8，9]，再灌注性心律失常是心肌缺血再灌注损伤中的一种主要表现形式，特别是室性心动过速及心室颤动。研究证实缺血预适应对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用，可减少恶性心律失常的发生。心肌缺血再灌注损伤的临床表现是心肌收缩功能下降、冠脉功能障碍、微小血管受损，并发生心肌组织水肿、黏附因子增加和白细胞浸润，从而引起细胞凋亡与心肌梗死，最终导致心脏功能减弱[10]。Sihvola等[11]的实验也显示TNF-α参与心肌重构的过程，是心肌凋亡的中介环节。并且TNF-α有直接的负性肌力作用，还可使细胞及生化异常，产生间接的负性肌力作用，抑制心肌收缩功能。TNF-α主要是有激活单核巨噬细胞分泌的一类以自分泌为主要作用方式，并且有多种生物学效应的细胞因子，产生于单核巨噬细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、某些应激状态下的成熟心肌细胞及体内多种其他细胞。健康心脏中仅有极低含量表达。在缺血和应激状态下，TNF-α可由成熟心肌细胞合成、分泌并参与多种心脏疾病的病理过程。 本次实验发现心脏冠状动脉结扎30 min再灌注后TNF-α含量明显增加，表明心肌组织进行再灌注时产生大量的TNF-α。TNF-α通过激活肽水解酶及蛋白水解酶讲解关键性收缩蛋白，包括肌钙蛋白，影响心肌收缩。TNF-α水平的升高与心肌功能抑制有明显的相关性，在心肌缺血再灌注损伤发展过程中。TNF-α可导致缺血后心肌功能不良，其主要机制是通过对心肌收缩力的直接影响而抑制心肌收缩功能和诱导心肌细胞发生细胞凋亡。

[1] Azfer A，Niu J，Rogers LM，et al.Activation of endoplasmic reticulum stress response during the development of ischemic heart disease[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，291(3)：H1411-H1420．

[2] 陈燕，夏豪，刘兰，等.心肌缺血再灌注损伤模型大鼠心肌组织及血清肌钙蛋白Ⅰ表达和心肌肿瘤坏死因子α与重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的干预[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15(37)：6879-6882.

[3] Hartford M，Wiklund O，Mattsson HL，et al.CRP，interleukin-6，secretory phospholipase A2group Ⅱ A，and intercellular adhesion molecule-1 during the early phase of acute coronary syndrotmes and longterm follow up[J].Int J Cardiol，2006，108(1)：55-62．

[4] Ke JJ，Wang YL，Li JG，et al.Pretreatment effect of adenosine on activation of NF-kappa B and level of TNF-alpha during myocardial ischemia and reperfusion in rate[J].Chin J Traumatol，2004，7(1)：25-27．

[5] 洪燕.心绞痛患者血肿瘤坏死因子及C反应蛋白浓度的变化[J].心血管康复医学杂志，2007，16(1)：34-35.

[6] 李袁静，汪道文，蔡明，等.建立小鼠急性心肌缺血再灌注损伤模型手术技巧及TTC染色方法探讨[J].山东医药，2010，50(40)：42-44.

[7] 刘艳伟，刘水平，成建定，等.大鼠心肌缺血再灌注模型的改进及心电图判定指标[J].实用儿科临床杂志，2007，22(7)：525-527.

[8] Tissier R，Souktani R，Bruneval P，et al.Adenosine A(1)-recepter induced rate preconditioning and myocardial infarction：Reperfusion duration is critical [J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2002，283(1)：38-43．

[9] Kitakaze M，Hori M，Kamada T.Role of adenosine and its interaction with α-adrenoceptor activity in ischaemic and reperfusion injury of the myocardia[J].Cardiovasc Res，2013，27(1)：18-20．

[10] 邓宇珺，曾红科.大鼠活体心肌缺血再灌注损伤模型的建立与综合评估[J].中国病理生理杂志，2011，27(2)：412-416.

[11] Sihvola RK，Koskinen PK，Pulkkinen VP，et al.Inhibition of tumor necrosis factor-alpha attenuates myocardial remodeling in rat cardiac allografts[J].Heart Lung Transplant，2006，25(5)：569-578．

(本文编辑 郭怀印)

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10．3969/j．issn．1672-1349．2015．10．006

1672-1349(2015)10-1169-03

2015-01-23)