Toll样受体2和4在抗孢子丝菌早期免疫阶段小鼠皮肤中的表达

张静 黄丽林 张晓辉 钟毅 何泰龙 袁立燕 黄怀球

孢子丝菌病是孢子丝菌复合体所致的深部真菌病，其发病机制与机体免疫状况和孢子丝菌毒力有关［1］。不同类型和强度的免疫反应导致疾病的不同流行病学分布和临床特征，因此，研究机体对孢子丝菌直接的免疫反应是明确孢子丝菌病发病机制的关键。孢子丝菌入侵时，机体通过早期免疫细胞膜表面的模式识别受体等各种免疫识别受体对其进行识别及介导各种免疫应答，但具体机制尚不明确。Toll样（TLR）受体家族是众多模式识别受体中重要的家族，已有研究表明，TLR4、TLR2参与了机体对孢子丝菌、白念珠菌、烟曲霉菌丝、马尔尼菲青霉的免疫识别［2-4］。目前研究已证实，TLR2和TLR4参与机体对真菌的免疫识别，进一步激活胞内信号分子，产生ROS和相关炎症细胞因子直接或间接参与真菌免疫清除。不同的真菌诱发的免疫反应类型及强度不同引起机体的组织病理改变亦不同［5］。本研究通过建立孢子丝菌BALB/c小鼠皮肤感染模型，检测其感染皮肤TLR2、TLR4 mRNA和蛋白表达水平及部位，探讨TLR通路在孢子丝菌感染中的意义。

资料和方法

一、资料

1.菌株来源：孢子丝菌CMCC（F）D1a株由中国微生物菌种保藏中心提供。

2.实验动物：60只雌性7～8周BALB/c小鼠由中山大学医学院动物中心提供，体重20～25 g，合格证号SCXK粤2004-0011。

3.主要试剂和仪器：沙堡弱培养基（日本和光纯药株式会社）、马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基（日本和光纯药株式会社），生理氯化钠液（北京恒安制药有限公司），Trizol试剂（美国Invitrogen公司），反转录试剂盒（立陶宛MBI Fermentas公司），滤膜（英国Whatman公司），实时荧光定量PCR系统（美国ABI公司），超微量紫外可见光分光光度计（中国ThermoFisher scientific公司）。

二、方法

1.孢子丝菌分生孢子悬液制备：将孢子丝菌CMCC（F）D1a株（菌丝相）转种至SDA斜面培养基，于培养箱中25℃培养活化7 d，然后转种至马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）斜面培养基上，培养1周后有产孢。用枪头将1 ml生理氯化钠液注入长满菌落的斜面，轻轻吹打，然后吸出至EP管。室温下静置20 min左右，待菌丝沉淀后，轻轻将上清液吸出至另一微量离心管。14 167×g离心5 min，去除上清液，加入2 ml生理氯化钠液。显微镜下观察，若有少量短菌丝可作为孢子计数，若短菌丝较多，可继续使用滤膜（Whatman No.1）进一步过滤。用血细胞计数板调整菌悬液至1×107cfu/ml。将已配置菌悬液稀释后接种于PDA平板，验证菌悬液活力及浓度。

2.小鼠皮肤感染模型：将60只BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组，每组随机分为6小组，即：接种前、接种后 6、12、24、48、96 h组，每小组5只小鼠，另设5只无处理空白对照组。在实验组，每只小鼠背部皮下注射0.1 ml浓度为1×107cfu/ml的孢子丝菌悬液，对照组则皮下注射生理氯化钠液。实验组及对照组小鼠均在处理后 6、12、24、48、96 h 处死并取其注射部位附近皮肤组织。HE染色和PAS染色后观察感染过程，组织培养出孢子丝菌即认为造模成功。

3.实时荧光定量PCR：获取的皮肤组织用Trizol试剂根据说明书进行总RNA提取，采用紫外分光光度计评估其完整性并估算其产量。按反转录试剂盒说明书合成cDNA。按照说明书采用ABI PRISM7000实时PCR嵌合荧光法，对TLR2和TLR4 mRNA进行相对定量分析，每个反应重复3次，结果取其平均值。实时PCR所用引物（表1）均由大连TaKaRa生物公司合成，内参基因为GAPDH。

4.免疫组化分析：皮肤组织常规石蜡包埋，切片。以PBS代替一抗作为阴性对照，光镜下观察TLR2及TLR4的表达。染色结果判定：染色强度依次为0分（无色），1分（淡黄色），2分（棕黄色），3分（棕褐色）；染色范围以染色阳性细胞所占百分比表示，＜25%、25%～50%、51%～75%、＞75%分别判定为0、1、2、3分；染色强度和阳性细胞百分比的乘积为免疫组化的结果：0、1～2、3～4、6～9分别判定为无（-）、弱（+）、中等（++）、大量（+++）。

5.ELISA：各组小鼠留取的血液自然凝固20min，4℃885×g离心20 min，ELISA法检测血清中促炎细胞因子IL-12、TNF-α含量，操作严格按照ELISA试剂盒说明书进行。

三、统计分析

用SPSS 16.0统计软件进行分析，计量资料符合方差齐性采用t检验，组间用方差分析，等级资料采用秩和检验，计量资料数据以±s表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、小鼠皮肤组织病理

皮下注射孢子丝菌分生孢子和生理氯化钠液96 h后，实验组及对照组均未发现肉眼可见皮损。但是切片HE染色显示，实验组有炎症细胞浸润，PAS染色可见酵母相真菌，而在对照组未见炎症细胞浸润及酵母相真菌。见图1。实验组皮肤组织可培养出孢子丝菌。

表1 实时荧光定量PCR所用引物

图1 小鼠皮肤接种孢子丝菌分生孢子96 h后组织病理改变（×400） 1A、1C：对照组；1B、1D：实验组。对照组皮肤无异常改变，PAS染色阴性；实验组有明显炎症细胞浸润，PAS染色可见酵母样真菌（箭头）

二、实时荧光定量PCR检测小鼠皮肤TLR2和TLR4 mRNA表达水平

正常BALB/c小鼠低表达TLR2和TLR4 mRNA。实验组TLR2 mRNA在6 h内升高，24 h达高峰（P＜0.05），随后逐渐下降，到96 h其表达与正常组差异无统计学意义（P＞0.05）。对照组TLR2 mRNA表达在生理氯化钠液处理后6 h内升高（P＜0.05），随后逐渐下降，在96 h与正常组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。在各个时间点，实验组的TLR2 mRNA水平均高于对照组（P＜0.05，图2）；TLR4 mRNA表达在孢子丝菌处理6 h内达高峰，随后逐渐降低。在对照组，TLR4 mRNA表达在6 h达高峰（P＜0.05），在其他时间点与正常小鼠相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）。在各个时间点，TLR2 mRNA水平在实验组均高于对照组（P＜0.05，图3）。

三、免疫组化检测小鼠皮肤TLR2和TLR4蛋白表达水平

图2 孢子丝菌和生理氯化钠液处理后不同时间小鼠皮肤TLR2 mRNA转录水平

正常小鼠皮肤不表达TLR2和TLR4蛋白（图4、5）。对照组小鼠皮肤未见TLR2明显表达，TLR4有弱表达。在孢子丝菌分生孢子组小鼠皮肤角质形成细胞膜上及细胞质可见TLR2中等量表达，TLR4较强表达。TLR2、TLR4在对照组小鼠真皮部位未见明显表达；在孢子丝菌分生孢子组小鼠真皮巨噬细胞膜上及细胞质可见TLR2较强表达，TLR4中等量表达。

四、ELISA检测血清中细胞因子IL-12、TNF-α含量

实验组血清中IL-12含量为29.25～31.17 ng/L，对照组为29.62～31.45 ng/L，两组随时间变化均无明显升高趋势，且各时间点两组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。实验组血清中TNF-α表达水平为272.80～300.06 ng/L，生理氯化钠液处理组为271.06～288.04 ng/L，两组随时间变化均无明显变化（P＞0.05），各时间点TNF-α的含量在两组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。

讨 论

图3 孢子丝菌和生理氯化钠液处理后不同时间小鼠皮肤TLR4 mRNA转录水平

图4 TLR2和TLR4在小鼠表皮的表达（免疫组化×400） 正常小鼠表皮TLR2、TLR4均未见明显表达；生理氯化钠液组小鼠表皮TLR2未见明显表达，TLR4有弱表达；感染孢子丝菌分生孢子组小鼠皮肤TLR2在角质形成细胞膜及胞质中等量表达，TLR4大量表达

图5 TLR2和TLR4在小鼠真皮的表达（免疫组化×400） 正常小鼠和生理氯化钠液组小鼠真皮TLR2、TLR4均未见明显表达；感染孢子丝菌分生孢子组小鼠真皮部位巨噬细胞膜上及细胞质可见TLR2大量表达、TLR4中等量表达

孢子丝菌可通过皮肤伤口感染机体并激活皮肤早期免疫反应系统，为了模仿人自然感染形成过程，通过皮下注射孢子丝菌分生孢子悬液建立动物皮肤感染模型。本研究结果显示，孢子丝菌可诱导小鼠皮肤TLR2和TLR4表达，提示TLR2和TLR4均参与了孢子丝菌的免疫识别。Sassa等［6］发现，感染孢子丝菌的TLR4基因缺陷小鼠腹腔巨噬细胞在体外24 h后再次予孢子丝菌的脂类提取物刺激，结果促炎症细胞因子TNF-α、NO和抗炎症细胞因子IL-10均表达下调，NF-κB转位到核内低于对照组。我们的研究也证实，孢子丝菌感染时，TLR4参与皮肤免疫识别，同时发现TLR2和TLR4 mRNA表达均呈现先升高后降低的趋势，提示与胞内信号激活后细胞因子反馈调节有关。实验组小鼠接种孢子丝菌后TLR2 mRNA皮肤表达在24 h达到高峰，TLR4 mRNA表达则在6 h达高峰，提示两者在不同时间段发挥作用。本研究结果显示，TLR4 mRNA表达水平高于TLR2 mRNA表达水平，提示在申克孢子丝菌早期免疫应答中TLR4起更重要作用。TLR2通过诱导未成熟树突细胞转化为成熟树突细胞并分泌IL-12 发挥作用［7］。TLR2 缺陷 BALB/c小鼠中，TLR4能够代偿TLR2这一功能，TLR4诱导成熟树突细胞分泌 IL-6 却比 TLR2 更显著［8］。Schauber等［9］发现，皮肤损伤可以通过维生素D依赖的机制促进TLR2的表达，本研究对照组小鼠TLR2和TLR4 mRNA表达在6 h后开始升高，与皮肤针刺损伤6 h后TLR2和TLR4 mRNA表达有关，穿刺损伤引起的炎症反应轻微，以致TLR2和TLR4 mRNA表达很快降至正常水平。

本研究发现，孢子丝菌诱导小鼠皮肤角质形成细胞TLR2和TLR4的表达，TLR2主要在表皮上层表达，TLR4 则在表皮全层表达。Pivarcsi等［10］发现，角质形成细胞可表达各种模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs），包括 TLR2 和 TLR4，微生物刺激角质形成细胞时，TLR通路可介导NF-κB、NO和各种炎症细胞因子的表达。促炎细胞因子IL-12和TNF-α是免疫系统激活的产物，其在孢子丝菌的免疫清除中发挥作用［11-12］。我们进一步通过ELISA检测TLR2和TLR4下游促炎细胞因子IL-12和TNF-α的分泌情况，发现与生理氯化钠液对照组相比，实验组在各时间点的IL-12和TNF-α含量变化均不明显，两组间比较均无统计学差异。这可能是机体处于早期免疫反应阶段，主要以局部的免疫细胞反应为主，尚未形成系统性免疫反应，故血液中的细胞因子释放量较少，反应不出与对照组之间的差异。

孢子丝菌接种后真皮巨噬细胞可表达TLR2和TLR4。巨噬细胞通过吞噬和杀伤孢子发挥抗真菌感染第一道防线，TLR可介导巨噬细胞的吞噬功能［13］。TLR2 介导巨噬细胞对烟曲霉的识别和吞噬［14］，TLR4在巨噬细胞防御真菌中的重要作用［6］，本研究也证实皮肤巨噬细胞TLR4和TLR2的表达在真菌感染防御中起作用。可见，孢子丝菌感染时，小鼠皮肤角质形成细胞和巨噬细胞共同表达TLR2和TLR4，发挥抗真菌免疫作用。

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