自行制备的HPV6b和11型E7蛋白多克隆抗体检测尖锐湿疣皮损的研究

曹蕾 程浩 王惠 周强 汤怡 姜少杰 丁杨 陈贤祯

尖锐湿疣多由低危型人乳头瘤病毒6型（HPV-6）和 11 型（HPV-11）感染引起［1］。由于病原学检测的实验室要求高，难以在临床尤其基层医院进行，造成不典型皮损的尖锐湿疣易误诊或漏诊。本研究采用自主研发制备的HPV6b和11型E7蛋白多克隆抗体对55例外阴尖锐湿疣皮损进行免疫组化检测，探讨检测这两种抗体的临床意义。

材料与方法

一、材料

1.临床资料：收集杭州市富阳区第一人民医院皮肤科2013年9月至2014年10月间确诊的55例尖锐湿疣皮损标本。男20例，女35例，年龄17～65（34.07±14.26）岁。53例为首诊病例，2例为复发病例。皮损数目不等，女性多分布于外阴，男性多分布于包皮和龟头。皮损表现典型，多为鸡冠或菜花状皮疹，醋酸白试验阳性。皮损活检病理可见典型的尖锐湿疣改变［2］。

2.主要试剂：免疫组化所用一抗HPV6b和11型E7蛋白兔多克隆抗体由浙江大学医学院附属邵逸夫医院皮肤科和生物医学研究中心自行研发制备。二抗为兔鼠混合型试剂盒（美国Invitrogen公司）。反转录聚合酶链反应（RT-PCR）所用试剂为DL2000 DNA Marker［宝生物工程（大连）有限公司］，琼脂糖（西班牙Biowest公司），Trizol（美国Invitrogen公司），Taq酶mix（美国Promega公司），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

二、方法

1.标本处理：局麻下用血管钳夹取部分疣体组织，生理氯化钠液冲洗后置入4%甲醛固定，常规组织病理检查，HE染色。其中18例同时取疣体-80℃冰冻保存。

2.免疫组化染色：55份尖锐湿疣皮损标本分别进行HPV6b和11型E7蛋白多克隆抗体免疫组化EnVision法染色：121℃高压修复抗原，室温下一抗（HPV6b和11型E7蛋白抗体稀释度分别为1∶1 000和1∶500）孵育60～90 min，二抗羊抗鼠/兔 IgG 孵育30 min，DAB色源底物溶液孵育1～3 min，其余步骤按试剂盒说明书操作。

3.结果观察和分析：镜下观察细胞染色情况，结合阳性细胞所占百分比和染色强度进行分析。每视野下染色阳性细胞所占皮损表皮细胞总数的百分比评定：阴性为0分，阳性细胞数≤25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。染色强度评定：阴性为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。根据两项评分之乘积判断结果：≤ 1为阴性（-），2～3为弱阳性（+），4～5为中度阳性（++），≥6为强阳性（+++），且认定+～+++为阳性表达［3-4］。每张HPV6b或11型E7阳性表达的免疫组化切片均在高倍镜（×400）下随机选取5个视野，计算每个视野中表皮各层HPV6b、11型E7蛋白阳性表达细胞数与各层细胞总数之比，取均数为表皮各层阳性表达细胞分布密度。

4.RT-PCR检测E7蛋白mRNA表达：设计检测HPV6b及11型E7基因的引物。HPV6b型E7基因引物（297 bp），正向 5′-ATGCATGGAAGACATGT TACCC-3′，反向 5′-TTAGGTCTTCGGTGCGCAGA T-3′；HPV11 型 E7 基因引物（297 bp），正向 5′-ATG CATGGAAGACTTGTTACCC-3′，反向 5′-TTATGGT TTTGGTGCGCAGATG-3′；GAPDH 引物（402 bp），正向 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA-3′；反向 5′-T TCACACCCATGACGAACAT-3′。Trizol一步法提取标本RNA，并通过紫外分光光度计测定浓度和纯度，经RT-PCR获得的产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像仪拍照分析。

5.统计学方法：采用SPSS17.0软件，数据分别采用χ2检验、单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、HPV6b和11型E7抗体免疫组化法检测尖锐湿疣皮损

免疫组化染色显示（图1），HPV6b和11型E7蛋白为表皮细胞胞核表达，均表现为胞核中棕黄色或棕褐色颗粒。55例尖锐湿疣皮损中HPV6b和11型E7蛋白总阳性表达52例（94.55%），两型E7蛋白双阳性表达22例（40.00%），见图1，两蛋白均阴性表达3例（5.45%）。HPV6b和11型E7蛋白阳性表达分别为42例（76.36%）和32例（58.18%），HPV6b型E7蛋白抗体阳性率显著高于HPV11型E7蛋白抗体（χ2=16.764，P=0.001）。两蛋白在皮损表皮全层均有阳性表达，但基底层细胞表达较多，棘层细胞次之，颗粒层细胞最少，两型E7蛋白在表皮各层阳性表达的细胞分布密度差异均有统计学意义（均P＜0.001）。见表 1。

二、RT-PCR检测HPV6b、11型E7 mRNA在尖锐湿疣皮损的表达

采用RT-PCR对18例尖锐湿疣冰冻标本皮损中HPV6b、11型E7 mRNA表达进行检测，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳可显示297 bp处明显的电泳条带，分子量与E7基因一致，提示HPV6b或11型E7 mRNA表达阳性。HPV6b和11型 E7 mRNA阳性表达分别为15例和10例，其中双阳性表达7例（图2）。RT-PCR法检测HPV6b和11型E7蛋白表达型别与免疫组化结果一致，符合率均为100%，且双阳性表达结果也完全一致。

图1 自制HPV6b和11型E7多克隆抗体免疫组化法检测同一份尖锐湿疣皮损（免疫组化EnVision法×100） 1A、1B：同一份尖锐湿疣皮损两型E7蛋白均表达阳性；1C、1D：同一份尖锐湿疣皮损HPV6b型E7蛋白阳性表达（1C），HPV11型E7蛋白表达阴性（1D）；1E、1F：同一份尖锐湿疣皮损HPV6b型E7蛋白表达阴性（1E），HPV11型E7蛋白表达阳性（1F）

讨 论

HPV早期基因编码的E7蛋白在HPV感染进程中通过多种途径发挥作用。本实验所用HPV6b和11型E7蛋白多克隆抗体是将自行构建表达并纯化的E7蛋白免疫新西兰兔后获得的兔多克隆抗体IgG，经Western印迹及免疫荧光鉴定，该兔抗IgG具有高效价性和抗HPV6b和11型E7蛋白特异性［5-6］。我们用这两型抗体，采用免疫组化法检测55份尖锐湿疣皮损标本，两抗体总阳性检出率为94.55%，高于陈珏［7］和颜丹等［8］的原位杂交及 FQ-PCR 检测结果。朱小霞等［9］用荧光定量PCR法检测尖锐湿疣皮损HPV6和11型，结果与本实验相似。本实验中两蛋白阳性检出率不同，有22份标本为HPV6b和11重叠感染，提示两型抗体无交叉反应。18例皮损组织通过RT-PCR法检测发现，HPV6b和11型的E7 mRNA阳性表达及型别与免疫组化结果完全一致，提示该两型抗体对尖锐湿疣皮损HPV6b、11的免疫组化检测敏感性好，特异性强，与尖锐湿疣临床诊断符合率高。有3例检测结果阴性，考虑有可能为HPV其他型感染。金纳等［10］用 HPV6 和 11 型 E6 基因引物介导PCR法检测发现，HPV11型明显多于 6b型，与本实验结果有一定差异，可能与受检人群的差异及检测方法不同有关。

表1 尖锐湿疣皮损组织HPV6b和11型E7蛋白在表皮各层阳性表达细胞分布（%，±s）

表1 尖锐湿疣皮损组织HPV6b和11型E7蛋白在表皮各层阳性表达细胞分布（%，±s）

注：a：表皮各层阳性表达细胞分布比较

H P V亚型 例数 基底层 棘层 颗粒层 F值a P值6 b 4 2 4 1.9 3 7±2 4.1 7 4 2 3.7 3 2±1 6.8 2 8 7.3 8 2±9.2 2 2 8 6.3 1 3 ＜0.0 0 1 1 1 3 2 2 7.7 9 6±2 5.8 8 5 1 9.0 3 6±2 1.4 9 8 5.6 6 2±1 2.5 5 5 3 4.0 6 3 ＜0.0 0 1

图2 尖锐湿疣皮损中HPV6b、11型E7 mRNA RT-PCR扩增产物电泳图 M：DL2000 DNA Marker；1～ 18：尖锐湿疣皮损标本

我们发现，HPV6b和11型E7蛋白在皮损表皮全层细胞均有阳性表达，但基底层细胞较多，棘层次之，颗粒层最少，提示用这两型抗体进行的免疫组化检测可非常直观地观察到HPV6b和11感染细胞。余俐等［11］用原位杂交和壳抗原免疫组化法检测尖锐湿疣皮损，发现两方法的阳性细胞主要位于表皮浅层，与本实验结果有一定差异。我们分析可能原因有：①原位杂交检测HPV DNA而非蛋白的表达；②病毒感染基底层细胞进行DNA复制，并随着细胞分化进入表皮浅层，而E7和L1蛋白分别与HPV早期和晚期蛋白有关。但确切原因还需增加样本量作进一步研究。

综上，本研究采用自行制备的HPV6b和11型E7蛋白抗体免疫组化法检测尖锐湿疣皮损，检测结果直观，可以观察到HPV6b和11型感染细胞在病损中的分布位置。检测方法简便易行，便于在有病理科的基层医院开展。

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