UPLC-TOF-MS 快速测定不同核用银杏品种银杏叶中银杏内酯和白果内酯含量

张 峥，叶小玉，肖 强，周大寨

生物资源保护与利用湖北省重点实验室 湖北民族学院，恩施 445000

银杏(Ginkgo biloba L.)是我国特产的银杏科银杏属的孑遗植物［1］。银杏叶提取物(简称GBE)及其制剂具有扩张冠状动脉血管、增强心肌收缩力、增加脑血流量、改善脑营养、保护神经元等多种生物活性［2，3］;已被用于治疗脑损伤后遗症、老年性痴呆、衰老、神经性疾病、帕金森病及老年性心血管系统机能衰退等症。现代药理学研究表明，银杏主要有效成分为黄酮甙和银杏内酯类化合物;目前为止发现银杏萜内酯8 个，分别是银杏内酯(A、B、C、J、K、L、M)和白果内酯(bilobalide)［4，5］，其中以银杏内酯A、B、C(简称GA、GB、GC)和白果内酯(bibobalide，简称BB)为主，它们具有特异性的抗血小板活化因子(PAF)活性［3］。由于GBE 产品中银杏内酯的含量通常很低，常用的高效液相色谱检测器(如紫外检测器)灵敏度不够，本底高且受其它杂质干扰不能适用［5，6］;示差折光检测器，一方面灵敏度比紫外检测器还差，另一方面则由于分离内酯时通常采用的梯度洗脱会产生基线漂移，容易造成定量不准［4，7］，蒸发激光散射检测器(ELSD)灵敏度高，选择性好，但其响应是非线性，带来定量误差［8］，难以用于质量控制中的定量分析。高效液相色谱(HPLC)与质谱(MS)联用技术结合了HPLC 分离和MS 定性的优势，TOF-MS 可以提供相对分子质量的高精度信息，本文通过超高压液相-飞行时间质谱联用(UPLC-TOF-MS)技术对银杏内酯进行质谱分析，采用其独特的选择离子流提取方式，提高了分析灵敏度，可在极短时间内实现对银杏内酯的快速定性和定量测定，满足分析需要。

1 材料与仪器

1.1 材料

2012 年6 月对鄂西南各县市银杏品种母树(经恩施州林业科学研究所吴代坤高级工程师鉴定)采集银杏叶，银杏叶置烘箱及时烘干粉碎，过40 目筛备用。

1.2 仪器、药品与试剂

Agilent 1290 液相色谱和飞行时间质谱仪(6224型)配有电喷雾电离(ESI)源和大气压化学电离源(APCI);采用Agilent Masshunter 工作站和数据处理软件对信号进行采集和数据处理。

银杏内酯样品:银杏内酯A(GA)、银杏内酯B(GB)、银杏内酯C(GC)、白果内酯(BB)对照品均购自中国药品生物制品检定所，批号分别为110862-201009、110863-200508、110864-200906、110865- 200605;甲酸(色谱纯)、乙腈(色谱纯):迪马科技有限公司产品;实验用水为超纯水(Milipore，Bedford，MA，USA)。

2 实验方法

2.1 色谱分析条件

Agilent ZORBAX C18(2.1×50 mm，1.8 μm)色谱柱。流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱程序如下:0～5 min，20%～45%乙腈，柱温25 ℃，流速0.2 mL/min。

2.2 质谱分析条件

ESI 离子源负模式，干燥气温度350 ℃，流速10 L/min;雾化器压力45 psig，毛细管电压3500 V，毛细管出口电压150 V，锥孔电压65 V，采集速度1.5 spectra/s，选择离子(EIC)采集模式，选定分子离子［M-H］-的质荷比分别为407.15(GA)，423.15(GB)，439.12(GC)，325.11(BB)。

2.3 混合标准溶液的配制

精密称取对照品GA 1.052 mg、GB 1.294 mg、GC 1.009 mg、BB1.055 mg，分别置于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，振摇使溶解，得银杏内酯对照品储备液。取BB 1 mL，GA、GB、GC 各200 μL，用甲醇定容至10 mL 制成混合对照品溶液。实际使用时再用甲醇适当稀释。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系

将上述对照品溶液分别稀释1.0、2.5、3.3、4.0、5.0 倍，按所设LC-MS 条件进样10 μL，测定进样量与相应质谱峰面积的关系。以内酯的选择性离子流色谱图(见图1)中峰面积为纵坐标，相应的内酯质量浓度为横坐标，对测定结果进行直线回归，求得GA、GB、GC、BB 的线性方程及相关系数，在0.2～4 μg/mL 范围内，4 种银杏内酯的线性关系如下:GA:Y=67940X-28506，R2=0.9999;GB:Y=2000000X+23738，R2=0.9996;GC:Y=2000000X+67415，R2=0.9996;BB:Y=57562X-9073，R2=0.9999。

图1 GA、GB、GC、BB 的选择离子流色谱图Fig.1 Extracted ion chromatograms(EIC)of GA，GB，GC and BB

2.4.2 精密度与准确性

按前述LC-MS 条件对同一混合标样重复测定4次，4 种内酯的相对标准偏差RSD 分别为GA:1.53%，GB:1.65%，GC:1.52%，BB:1.26%，说明本方法较为准确、可靠。

2.4.3 重复性

取银杏叶样品5 份，按照2.5 项下方法制备供试样品溶液，连续进样5 次，记录色谱图。结果表明4 种内酯的相对标准偏差RSD 均小于3.8%，符合定量分析要求，表明方法的重复性良好。

2.5 样品制备

精确称取银杏叶样品2.0 g，加入50%乙醇溶液置于索氏提取器中70 ℃提取2 h，冷却抽滤，滤渣加入50%乙醇溶液再次提取2 h;合并两次得到的提取液旋转蒸发至干，然后加10 mL 蒸馏水及0.3 g乙酸钠溶解，加入等体积乙酸乙酯萃取两次，合并有机相旋转蒸发至干，用甲醇溶解并定容至10 mL。

3 结果与分析

用前述方法对鄂西南不同银杏品种叶片的4 种内酯进行了测定，经回归方程计算各种内酯的含量，由表1 可见，不同品种间白果内酯含量差异具有极显著性，其中以恩银23 号含量最高，较含量最低的恩银1 号高出1 倍以上;4 种内酯总含量在各品种间差异极显著，其中，恩银23 号总内酯含量在四个品种最高;而恩银2 号则最低。

表1 不同银杏品种叶片白果内酯和银杏内酯含量(n=3，±s)Table 1 The contents of bibobalides and gingkolides in the leaves of G.biloba from different species(n=3，±s)

表1 不同银杏品种叶片白果内酯和银杏内酯含量(n=3，±s)Table 1 The contents of bibobalides and gingkolides in the leaves of G.biloba from different species(n=3，±s)

注:同一栏内数据后不同字母者在0.05 水平上差异显著。Note:Values followed by a different letter were of significant difference at the 0.05 probability level.

4 讨论

由于各种银杏内酯的结构很相似，且无特征紫外吸收，虽然在210 nm 处有紫外吸收，但此波长与洗脱溶剂甲醇或乙腈紫外吸收截止波长非常接近，容易造成紫外检测背景值偏高。另外，一般情况下所测样品中银杏内酯的含量非常低，对于灵敏度不高的检测器，如紫外、示差等，样品需反复多次提取、纯化、浓缩，以提高银杏内酯的浓度，才能进行检测，如此众多的环节往往带来较大的检测误差。基于其它检测器存在的缺陷。作者采用飞行时间质谱仪作为检测器，用液-质联用仪进行定量分析。由于它灵敏度很高，0.2 μg/mL 银杏内酯即可产生足够的质谱信号，解决了灵敏度问题，且具有较好准确性好;另一方面，紫外等检测器对于性质相近GA、GB 出现的共流出无能为力，不能进行准确定量;从图1 可见，在选定分离条件下，GA 和GB 存在共流出，但质谱仪通过EIC 功能可以准确定量共流出峰不同离子，从而做到同时准确定量4 种主要银杏内酯。

液-质联用仪的质谱采用软电离方式，即电喷雾电离(ESI)和大气压化学电离(APCI)，在它的总离子流质量色谱图上能得到较强的分子离子峰(［M+H］+或［M-H］+，M 代表相对分子质量);根据银杏内酯的结构中含有很多氧原子及活泼羟基，故选择ESI 负离子采集方式。用自动进样器直接进样，调节各参数，以得到最强的分子离子峰(［M-H］+)，确定最佳实验条件;同时采用质谱的EIC 选择离子流提取方式提取色谱图，即选定407.15(MGA-1)、423.15(MGB-1)、439.12(MGC-1)、325.11(MBB-1)4 个相对分子质量进行色谱提取，进一步提高了银杏内酯的检出灵敏度。

作者采用近年来迅速发展的UPLC-MS 方法，利用超高压液相色谱实现微量样品的迅速分离，本方法在4 分钟内即完成了四种主要银杏内酯的分离，较其它液质联用方法［9］相比，大大节约了洗脱溶剂的消耗，节省了宝贵的时间;采用TOF-MS 作为检测器，发挥其灵敏度高、精密度与准确性好的优点，实现了短时间内对样品中微量银杏内酯的定量检测。基于上述方法，利用自动进样器可以实现对大量样品的快速准确定量。

目前国际上一般公认的银杏叶制品质量指标为1991 年德国Schwabe 制药厂生产的产品EGb761 标准，即黄酮苷24%以上，内酯6%以上，银杏酸10 mg/kg 以下。其中，3 种苷元的大体比例是3∶2.6∶1。内酯中白果内酯与萜内酯的含量大致相等，而萜内酯A、B、C 的比例约为2∶2∶1［10］。本研究表明，在恩银23 号叶片中，4 种内酯含量在4 个品种中最高，同时白果内酯和萜内酯的含量之比约为1.5:1，且萜内酯A、B、C 的比例接近1.5∶1.5∶1，适合作为叶用银杏品种开发的优选品种。

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