浊点萃取法结合超声波提取连翘叶中叶绿素

栗亚云，陈廷贵，张立伟

化学生物学与分子工程教育部重点实验室 山西大学分子科学研究所，太原 030006

叶绿素用途非常广泛，可用于医药、保健品、化妆品、食品色素以及化工等领域［1-4］。在药用方面，叶绿素是强抗氧化剂，可防止各种氧自由基所致的氧化损害，从而减少DNA 损伤［5，6］;此外，叶绿素还能有效抑制黄曲霉毒素的致癌效应，具有显著的抗癌作用［7，8］;同时叶绿素以及叶绿素铜钠盐等还具有抗贫血、抗溃疡、抗菌、抗病毒、保肝排毒等诸多药理作用［9］。在化妆品方面，近年来人工合成色素导致皮肤病急剧增加，由合成色素而引起的皮肤功能障碍占43.9%，长期使用会使皮肤对光线敏感，从而导致色素沉着，还伴有皮肤潮红、丘疹等炎症现象［10］。在食品色素方面，国内由于苏丹红事件，合成色素受到严格的限制，美国批准的合成色素从700 种锐减到了7 种［11］，人们越来越多的开始重视天然色素的研究应用。除上述应用之外，叶绿素还可应用于军事伪装和光动力学治疗癌症等方面［12，13］。

常用的叶绿素的提取方法，主要有以下几种:丙酮研磨法、溶剂加热提取法、浸渍压榨法、超声波提取法、微波辅助提取法、超临界流动萃取法和生物工程法等。溶剂提取法最常使用，该方法工艺简单，但试剂用量大。浸渍压榨法浸渍时间长，产品得率低，溶剂消耗量也很大。超临界流体萃取法萃取温度低、速度快，但超临界萃取设备投资费用过高，影响其应用推广。生物工程法步骤多，工作量较大［14］。上述各方法提取所使用的溶剂一般包括乙醇、丙酮、苯、氯仿、乙醚、石油醚等有机溶剂，这些溶剂易燃、易爆、有挥发性，有的还有毒性，安全性差［2，15，16］。

浊点萃取技术(Cloud Point Extraction，CPE)，以水代替有机溶剂作为萃取剂，通过加入少量表面活性剂产生浊点现象而实现高效提取［17，18］。连翘叶为木犀科连翘属植物连翘［Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl］的叶子，连翘作为一种常用中药，具有抗炎、抗病毒、解热、抗肝损伤、抑制cAMP 磷酸二酯酶等作用，我国连翘年产量约在7500 吨左右［19，20］，资源丰富，人们在对连翘果实利用的同时往往忽略了叶子的利用，造成资源的极大浪费，因此开发连翘叶具有重要意义。

本研究首次使用Triton X-114 水溶液作为提取溶剂，结合超声波技术，以连翘叶为例提取叶绿素，取得了成功。该方法打破了长期以来只能使用有机溶剂提取叶绿素的限制，为叶绿素的开发利用提供了一种经济、安全、高效、简便、省时、环保新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

连翘叶，采于山西大学校园内，经山西大学张立伟教授鉴定为木犀科连翘属植物连翘的叶子。采样后，将新鲜连翘叶洗净、沥水，摊开放置于阴凉处，阴干，粉碎。

Triton X-114 购买于Solarbio 科技有限公司，95%乙醇、无水乙醇等均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

微型高速万能试样粉碎机(黄烨市齐家荣科学仪器厂)、OHAUS CP114 电子天平(美国奥豪斯仪器有限公司)、KQ-250 DB 数控超声波清洗器(巩义市英峪予华仪器厂)、SHZ-C 型循环水式多用真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)、Varian Cary 50 紫外-可见分光光度计(美国Varian 公司)、10 mm 石英荧光比色皿(江苏晶禾光学仪器有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 叶绿素浊点萃取

准确称取连翘叶粉末10 g，置于250 mL 圆底烧瓶中，加入100 mL 5%的Triton X-114 水溶液，盖塞，振荡混匀，250 W 超声处理15 min，抽滤，得滤液，将其倒入分液漏斗，静置分层，去除下层水相，取上层表面活性剂富集相。加入30 mL 95%乙醇以降低体系粘度，用0.45 μm 滤膜过滤除去Triton X-114，将滤液浓缩，得叶绿素浸膏。

取少量叶绿素浸膏溶于95%乙醇，用紫外可见分光光度计对400～800 nm 波段进行扫描，然后根据Amon 公式对叶绿素含量进行计算［2］。

1.3.2 单因素考察

1.3.2.1 Triton X-114 浓度的确定

准确称取0.5 g 连翘叶粉末6 份，分别置于10 mL 锥形瓶中，依次加入5 mL 浓度为1%、2%、3%、4%、5%、8%的Triton X-114 水溶液，盖塞，振荡混匀，250 W 超声处理15 min，抽滤，将滤液转移至250 mL 容量瓶中，用95%乙醇定容，分别测定其在665 nm 处的吸光度值。重复3 次实验。

1.3.2.2 超声时间的确定

按上述方法，设定料液比为1∶10，Triton X-114水溶液浓度为4%，分别测定超声时间为8、10、13、15、18、20 min 时，665 nm 处的吸光度值。重复3 次实验。

1.3.2.3 料液比的确定

按上述方法，设定Triton X-114 水溶液浓度为4%，超声时间为13 min，分别测定料液比为1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15 时，665 nm 处的吸光度值。重复3 次实验。

1.3.3 正交试验设计

根据各单因素实验所得的Triton X-114 浓度、超声时间、料液比3 个因素的最佳条件，进行三因素三水平L9(33)正交试验，设计结果见表1。

表1 正交试验水平因素Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.3.4 与传统溶剂提取法和超声波提取法比较

准确称取0.5 g 连翘叶粉末3 份，置于锥形瓶中，分别按照本实验提取方法、刘邻渭等［4］的传统溶剂提取法和超声波提取法(以乙醇替代本实验提取方法中的提取溶剂，其它条件不变)提取叶绿素，提取完毕后，分别将提取液转移至250 mL 容量瓶中，用95%乙醇定容，测定其在665 nm 处的吸光度值。重复3 次实验。

2 结果与讨论

2.1 叶绿素提取物光谱分析

用紫外-可见吸收分光光度计对实验所得叶绿素提取物进行扫描，得紫外可见吸收光谱如图1。由图可知提取液在665 nm 处有明显的吸收峰，610、430、410 nm 处均有吸收峰，与文献报道叶绿素a 出峰位置一致，因此可判定该提取方法成功地从连翘叶中提取到了叶绿素。本文选用665 nm 处的吸光度值作为进一步分析叶绿素提取效率高低的指标。

图1 连翘叶提取物紫外可见吸收光谱图Fig.1 UV-VIS spectrum of F.suspensa leave extract

2.2 单因素筛选结果

对该提取方法中的Triton X-114 浓度、超声时间、料液比进行各单因素考察，结果见图2。由图2(A)可得，随着Triton X-114 浓度的增加，吸光度值逐渐升高，但是浓度达到4%后，吸光度值随浓度的增加略有降低，所以得Triton X-114 的最佳浓度是4%。当Triton X-114 浓度大于4%时，提取率下降的原因是随着表面活性剂浓度增大，整个提取体系粘度增大，这不利于叶绿素的浸出扩散，故而提取率开始下降。

由图2(B)可得，随着超声时间的延长，吸光度值逐渐升高，但当时间达到13 min 后，吸光度值随时间的延长有明显下降趋势，故最佳超声时长为13 min。由于超声波本身的机械和生化效应会对叶绿素造成一定的破坏［21］，因此当超声时间过长时，提取率表现为一定程度的下降。

由图2(C)可知，随着料液比的增长，吸光度值逐渐升高，但当其比例达到1∶10 以后，吸光度值随料液化的增加略有降低，因此最佳料液比为1∶10。这可能是因为用相同功率的超声波辅助提取时，超声波在较多溶剂的体系中，被溶剂介质吸收而衰减的能量较多，使提取出来的叶绿素量减少［22］，当料液比达到一定比例时，该因素的影响开始占主导作用，从而导致叶绿素的提取率呈下降趋势。

图2 Triton X-114 浓度(A)、超声时间(B)、料液比(C)对叶绿素提取效果的影响Fig.2 Effects of Triton X-114 concentration(A)，ultrasonic time(B)，Solid-liquid ratio(C)on the extraction yield of chlorophyll

2.3 正交试验结果

采用Minitab 软件设计L9(33)正交试验，对其结果进行方差分析，结果见表2、表3。

表2 正交试验结果分析Table 2 Orthogonal test results

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

从表2 中可知，因素A(Triton X-114 浓度)的K值:K2＞K3＞K1;因素B(超声时间)的K 值:K1＞K2＞K3;因素C(料液比)的K 值:K2＞K1＞K3;说明最优水平为:A2B1C2。在所选因素水平范围内，因素B的极差R 最大，因此超声时间是主要影响因素;其次是因素C 和A，故各因素对叶绿素得率的影响程度依次为B＞C＞A。

从表3，F 值大小依次为B＞C＞A，与极差分析结果一致。各因素对实验结果均无显著性影响。因此，浊点萃取法结合超声波提取叶绿素的最佳条件为A2B1C2，即Triton X-114 浓度为4%，超声时间为11 min，料液比为1∶10。

以正交试验所得最佳提取条件重复提取3 次，检测得665 nm 处的平均吸光度值为1.1805，计算得叶绿素平均提取率为6.65 mg/g，详见表4。

2.4 与传统方法和超声波提取法比较讨论

按“1.3.4”项方法进行实验，重复3 次，结果如表4 所示。从表中可知，该提取方法与传统工艺相比，平均提取率提高了9.92%，同时该方法具有安全、无污染、经济、省时、无需加热、节约能源等优点;与超声波提取法相比，在相同条件下，平均提取率提高了11.58%。

表4 不同提取方法提取叶绿素比较Table 4 Comparison of different chlorophyll extraction methods

3 结论与展望

本研究提供了一种新的提取叶绿素的方法。首先，本提取方法以Triton X-114 水溶液为提取剂，具有工艺设备简单、不使用挥发性有毒试剂、安全、环保、省时、无需加热、节约能源、提取率高等优点，这为企业安全、经济、高效生产叶绿素提供了保证。其次，连翘以果实入药，但连翘叶大都被弃之不用，造成了资源的极大浪费，本研究从连翘叶中提取叶绿素，为综合开发连翘资源打下了基础。第三，对于含叶绿素茎叶的中草药，要提取它们的有效成分，首要任务就是去除叶绿素，本研究为去除连翘叶及其它中草药中叶绿素提供了一种新手段。第四，该方法适用于从任何含叶绿素的植物的茎和叶中提取叶绿素，且使叶绿素的获取变得更加容易，这将会促进叶绿素在医药、保健品、化妆品、食品色素以及化工等领域的广泛应用。

1 Xie HB(谢惠波)，Yang ZW(杨宗伟)，Chen L(陈丽)，et al.Natural pigment-a review on the extraction，development and utilization of chlorophyll.China Food(中国食品工业)，2010，2:58-60.

2 Huang CD(黄持都)，Hu XS(胡小松)，Liao XJ(廖小军)，et al.The advancement of chlorophyll.China Food Addit(中国食品添加剂)，2007，3:114-118.

3 Huang SW(黄寿吾).Pharmacology and clinical application of chlorophyll.Food Drug A(食品与药品A)，2006，8(4):5-8.

4 Liu LW(刘邻渭)，Yuan L(袁琳)，Sun LF(孙丽芳)，et al.Comparison of extraction rates，stabilities and application properties of chlorophyll from 8 kinds of leaves.Sci Tech Food Ind(食品工业科技)，2012，1:245-249.

5 Cervantes B，Yahia EM，Victoria C，et al.Antioxidant activity and content of chlorophylls and carotenoids in raw and heat-processed Jalapeno peppers at intermediate stages of ripening.Food Chem，2014，146:188-196.

6 Ursula M，Lanfer M，Rosa MC，et al.Antioxidant activity of chlorophylls and their derivatives.Food Res Int，2005，38:885-891.

7 Mario G，Ferruzzi，Joshua BD，Absorption，and cancer preventative activity of dietary chlorophyll derivatives.Nutr Res，2007，27:1-12.

8 Patricia AE，Wang JB，Zhu YR，et al.Chlorophyllin intervention reduces aflatoxin-DNA adducts in individuals at high risk for liver cancer.P Natl Acad Sci USA，2001，98:14601-14606.

9 Zheng GD(郑国栋)，Ouyang W(欧阳文)，Yan M(颜苗)，et al.The pharmacological advancement of chlorophyll and its derivatives.Cent South Pharm(中南药学)，2006，4:146-148.

10 Wu J(吴晶)，Huang L(黄澜)，Lv GY(吕圭源)，et al.Review in the research of pharmacological activities of natural pigment.Lishizhen Med Mater Med Res(时珍国医国药)，2005，16:915-916.

11 Shen GQ(沈国强)，Yang CX(杨春霞)，Zhang D(张栋)，et al.Research and development of nature colorant(dyestuff).Dyest Color(染料与染色)，2009，46:7-10.

12 Yang YJ(杨玉杰)，Hu BR(胡碧茹)，Wu WJ(吴文健)，et al.Stabilization and camouflage application of chlorophyll.J Funct Mater(功能材料)，2011，42:374-376.

13 Liu XP(柳新平)，Wang XM(王新明)，Zhou KW(周开文)，et al.The advancement of chlorophyll in cancer prevention and treatment progress.Chin J Clin Oncol Rehab(中国肿瘤临床与康复)，2007，14:269-271.

14 Hui QS(惠秋沙).Outline of research on natural pigments.J North Pharm(北方药学)，2011，8(5):3-4.

15 Meng QY(孟庆廷).Research Development on Production and Stability of Chlorophyll.Hebei Chem Eng Ind(河北化工)，2009，32(3):2-3.

16 Guan JY(关锦毅)，Hao ZB(郝再彬)，Zhang D(张达)，et al.A review on the extraction，detection and Biological function of chlorophyll.J Northeast Agric Univ(东北农业大学学报)，2009，40:130-134.

17 Zain NNM，Abu BNK，Mohamad S，et al.Optimization of a greener method for removal phenol species by cloud point extraction and spectrophotometry.Spectrochim Acta A，2014，118:1121-1128.

18 Liu TT，Cao P，Geng JP，et al.Determination of triazine herbicides in milk by cloud point extraction and high-performance liquid chromatography.Food Chem，2014，142:358-364.

19 Yan LL(闫丽丽)，Jiang Y(姜颖).The summary of the main chemical components and pharmacological activity research of Forsythia medicinal.China New Technol Prod(中国新技术新产品)，2011，11:11.

20 Li HP(李焕普).May have one thousand tous gap of Forsythia supply this year.J Chin Tradit Med(中国中医药报)，第2549 期.

21 Ma HY(马海燕)，Zhang M(张慜)，Sun JC(孙金才).The application study of ultrasonic-ozone combined treatments in quick-frozen Broccoli.J Food Sci Biotech(食品与生物技术学报)，2010，29:538-543.

22 Wang LJ(王立娟).Technology for extracting chlorophyll from leaves of Syringa oblata L.by ultrasonic-assisted method.T CSAE(农业工程学报)，2001，25:171-174.