枫杨树皮抗菌物质的分离鉴定研究

罗 彭，王佳佳，李 兵，郭占京，廖彭莹，陈 俊，李汉浠，潘为高

广西中医药大学，南宁 530001

枫杨(Pterocarya stenoptera C.DC.)为胡桃科枫杨属植物［1］，原产我国，地域分布广泛、枝条扦插即活，生长繁殖迅速，属于极易可再生资源。枫杨在抗肿瘤、抗病毒、杀灭钉螺等方面有一定的药用价值;但其更为重要的价值，是在民间作为传统外用中药用于治疗各类真菌性皮肤病和细菌性脓、疮［2］，此用药习惯在古籍、古方及当代中药书籍中均有大量记载，用法是将其树皮、树叶捣碎用于治疗疥癣、脚癣、头癣［3］和其它病菌性疾病［4］。枫杨抗菌用药历史悠久，疗效肯定，用药安全性也得到了时间的验证。

枫杨的抗菌物质基础研究，目前才刚刚起步。张兴悦［5］等证实枫杨乙醇或丙酮提取物有抑菌作用，但并未开展活性单体层面的研究。笔者前期研究从枫杨树皮分离纯化得到了一个抗菌单体5-羟基-2-乙氧基-1，4-萘醌［13］，但研究并不系统。本研究前期发现枫杨中还有许多尚待分离的潜在抗菌成分。本研究通过生物活性跟踪法与现代分离纯化技术结合，系统地开展枫杨的抗菌活性物质的追踪研究，尽可能全面探明其抗菌作用的物质基础，寻找新的抗菌素，同时为研制抗菌活性部位药及控制药材质量奠定基础。

1 材料与仪器

1.1 药材

药材采集于广西桂林兴安县五里峡坝区，经广西中医药大学韦松基教授鉴定为胡桃科枫杨属植物枫杨(Pterocarya stenoptera C.DC.)的树皮。药材阴干、粉碎，于4 ℃密闭保存。

1.2 试剂

石油醚(30～60 ℃、60～90 ℃两种沸程规格)、氯仿(AR)、二氯甲烷(AR)、乙酸乙酯(AR)、无水乙醇(AR)、丙酮(AR)均由西陇化工股份有限公司生产;柱层析硅胶(100～200、200～300 目)和薄层层析硅胶H(60 型)购于青岛海洋化工集团公司;10 cm×20 cm 硅胶G 板为武安市诚朋科技开发有限公司产品;Sephadex LH-20 葡聚糖为瑞士安玛西亚产品。

1.3 菌种

卡拉双球菌(Dipococcus cata)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙 门 氏 菌(Salmonella sp.)、白 色 念 球 菌(canidia Albicans)、棉花球菌(Cotton cocci)、鞭毛菌(Mastigomycotina)、放线菌(Actinomycete)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、姜瘟菌(Pseudomonas solanacearum)、小麦赤霉(Fusarium graminerum)、玉米大斑菌(Exserohilum-trucicum)、墨入菌(Phoma wasabiae)等菌种由四川大学生命科学学院微生物研究室提供。

1.4 仪器与设备

HD-650 超净台(吴江市伟峰净化设备有限公司);DZF-2001 真空干燥箱(上海浦东跃欣科学仪器厂);RE-52AA 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);100～1000 μL 量程及10～100 μL 量程移液枪(Eppendorf);Mettler-AE100 电子分析天平(瑞士Mettler公司);Bruker Avance-600 型和Bruker AM-400 型核磁共振波谱仪(瑞士布鲁克公司);Agilent 6890/5973N 型GC-MS 联用仪(美国安捷伦公司)。

2 实验方法

2.1 抗菌活性的测定方法

2.1.1 肉汤琼脂培养基的配制

蛋白胨10 g，氯化钠5 g，牛肉浸膏3 g，琼脂20 g，水1000 mL，加热溶化后滤过，用pH 计调pH 值至7.4～7.6，0.15 Mpa 灭菌20 min，待用(细菌、真菌在此培养基上均能良好生长)。

2.1.2 药物配制

用于实验的各化合物(药物)均进行干燥，彻底除去溶剂。药物用灭菌注射用水配制，用少量无菌DMSO 助溶，均配成统一浓度10 g/L(1.0%)。

2.1.3 琼脂平板打孔法测定抗菌活性(一菌多药，定性测定)

在无菌平皿内加入熔化的肉汤琼脂培养基，凝固后作为底层(厚约0.5 cm);再取50 ℃熔化的肉汤琼脂培养基，铺在底层之上，凝固后作为上层(厚约0.5 cm)。用推平板接种法，将供试验菌液均匀地涂布于琼脂平板的表面，用无菌打孔器打孔，孔径0.5 cm，只打穿上层琼脂，孔距2 cm，均匀分布。用移液器分别吸取各药液约90 μL 加于各琼脂孔内。于37 ℃培养18～24 h，观察孔周围有无抑菌圈，通过抑菌圈的大小比较各药物的抗菌效力。

2.2 抗菌活性成分的分离纯化

枫杨树皮粗粉3.0 kg，用约30 倍量90%乙醇渗漉提取，滤液负压浓缩回收溶剂，敞口水浴挥发得乙醇干膏约300.0 g。药材残渣，再用20 倍量水渗漉提取，滤液浓缩干燥后得水提取干膏约233.0 g。

进行抗菌测定，发现水提取物对各菌无明显抑制作用，90%乙醇提取物对卡拉双球菌、白色念球菌、棉花球菌、鞭毛菌、放线菌、大肠杆菌、姜瘟菌、金黄色葡萄球菌、玉米弯孢菌、玉米大斑菌、墨入菌均具有不同程度的抑制作用，其中对卡拉双球菌、小麦亦霉的抑制作用最强。故而后续抗菌活性成分的分离纯化起始部位采用90%乙醇提取物，选用抗菌效果最为显著的卡拉双球菌(细菌)、小麦赤霉(真菌)作为筛选活性成分的实验用菌。

300 g 乙醇提取物用适量热水悬浮，用60～90℃沸程石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，得石油醚部位51 g、氯仿部位42 g、乙酸乙酯部位44 g、正丁醇部位77 g、水层部位86 g，经抗菌实验发现，氯仿部位有很强的抗菌作用，石油醚部位、乙酸乙酯部位抗菌作用较弱，正丁醇部位和水层部位无抗菌作用。

40 g 氯仿部位用甲醇热溶，适量硅胶分散制样并干燥。1000 g 硅胶(100～200 目，柱内径10 cm)湿法装柱，上样，用氯仿:甲醇梯度洗脱(80∶1→40∶1→20∶1→10∶1→5∶1→甲醇)，得6 个梯度流份。经体外抗菌指标检测，40∶1、10∶1、5∶1 流份段有高活性，其余流份段无活性。

将上述40∶1 流份段(量较大)上硅胶中柱(200～300 目，柱内径5 cm，高20 cm)，用石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脱(20∶1→10∶1→甲醇)，得到3 个梯度流份，经体外抗菌指标检测，其中10∶1、甲醇流份段为高活性段，20∶1 流份段为低活性段。将10∶1 流份段上硅胶小柱(薄层硅胶H，柱内径2 cm，高30 cm，N2加压)，经石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脱(10∶1→甲醇)，得红色针状结晶1(24 mg)、2(20 mg)和甲醇段，经体外抗菌指标检测，结晶1、2 均有明显的抑菌效果，而甲醇段无活性。

将上述40∶1 中得到的高活性甲醇流份段直接上硅胶小柱，经石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脱(4∶1→2∶1→乙酸乙酯)，在2∶1 梯度洗脱时分离得到黄色针状结晶3(10 mg)，经抗菌指标检测，结晶3 有明显的抑菌效果，其余流份段无活性。

将乙酸乙酯部位(28 g)上硅胶大柱，用二氯甲烷∶甲醇梯度洗脱，在5∶1 梯度得到浅黄色针状结晶4，经体外抗菌指标检测，有明显的抑菌效果。

对抗菌活性结晶1、2、3、4 分别用Sephadex LH-20 葡聚糖凝胶色谱柱进行除杂，二氯甲烷∶甲醇(1∶1)洗脱，得到各高纯度单体，经TLC 薄层确定纯度，用于结构研究。

2.3 抗菌活性物质的结构鉴定

EI-MS 在Agilent 6890/5973N 型GC-MS 联用仪上进行，电离方式EI+，电子能量70 eV，扫描范围50～1000 Da。

1D NMR(1H、13C、DEPT)和2D NMR(HSQC、1H-1H COSY、HMBC)在Bruker Avance-600 型和Bruker AM-400 型核磁共振波谱仪上进行。1H 频率为600(或400 MHz)，13C 频率为125(或100)MHz，溶剂为CDCl3或CD3OD，TMS 为内标，常温20 ℃测定。

3 实验结果

化合物1 红色针状结晶，易溶于乙酸乙酯、丙酮、氯仿、甲醇，不溶于水。三种不同的展开剂系统进行硅胶TCL 检测，氨显，均为粉红色单斑［石油醚∶乙酸乙酯(8∶1)，Rf=0.40;石油醚∶丙酮(6∶1)，Rf=0.0.48;氯仿∶甲醇(60∶1)，Rf=0.83］，纯度符合波谱测定要求。EI-MS m/z∶174［M］+(基峰)，146，118，92，63.综合分析化合物1 的1H NMR、13C NMR、DEPT、HSQC、1H-1H COSY 和HMBC 数据(表1)，并参照文献［6］，确定该化合物为5-羟基-1，4-萘醌(C10H6O3，M=174，胡桃醌，图1)。

化合物2 红色针状结晶，易溶于乙酸乙酯、丙酮、氯仿、甲醇，不溶于水。三种不同的展开剂系统进行硅胶TCL 检测，氨显，均为粉红色单斑［石油醚∶乙酸乙酯(2∶1)，Rf=0.65;石油醚∶丙酮(4∶1)，Rf=0.43;氯仿∶甲醇(80∶1)，Rf=0.62］，纯度符合波谱测定要求。EI-MS m/z∶204［M］+(基峰)，174，147，105，63.综合分析化合物2 的1H NMR、13C NMR、DEPT、HSQC、1H-1H COSY 和HMBC 数据(表1)，并参照文献［7］，确定该化合物为5-羟基-2-甲氧基-1，4-萘醌(C11H8O4，M=204，图1)。

化合物3 黄色针状结晶，易溶于乙酸乙酯、丙酮、氯仿，不溶于甲醇、水。三种不同的展开剂系统进行硅胶TCL 检测，紫外下均显暗紫色单斑［石油醚∶乙酸乙酯(1∶1)，Rf=0.42;石油醚∶丙酮(2∶1)，Rf=0.43;氯仿∶甲醇(30∶1)，Rf=0.75］，纯度符合波谱测定要求。EI-MS m/z∶168［M］+，153，127，97，69(基峰)，50。综合分析化合物3 的1H NMR、13C NMR、DEPT、HSQC、1H-1H COSY 和HMBC 数据(表1)，并参照文献［8］，确定该化合物为2，6-二甲氧基-1，4-对苯醌(C8H8O4，M=168，图1)。

化合物4 浅黄色针状结晶，溶于甲醇，不溶于氯仿。三种不同的展开剂系统进行硅胶TCL 检测，硫酸-乙醇显色及碘显色，均为棕黄色单斑［环己烷∶乙酸乙酯(6∶1)，Rf=0.74;石油醚∶乙酸乙酯∶冰醋酸(40∶10∶1)，Rf=0.70;氯仿∶甲醇∶冰醋酸(9∶4∶1)，Rf=0.54］，纯度符合波谱测定要求。EI-MS m/z:170［M］+(基峰)，153，152，125，77;1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:7.06(2H，s，H-2，6);13C NMR和DEPT(100 MHz，CD3OD)δ:170.5(C-7，C)，146.4(C-3，5，C)，139.6(C-4，C)，121.9(C-1，C)，110.3(C-2，6，CH)。核磁数据与文献报道［9］的没食子酸的数据一致，因此化合物4 鉴定为3，4，5，-三羟基苯甲酸(C7H6O5，M=170，图1)。

表1 化合物1、2、3 的一维和二维核磁谱数据(600/150 MHz to TMS，CDCl3)Table 1 1D-and 2D NMR spectral data of compounds 1，2 and 3(in CDCl3at 600/150 MHz to TMS)

图1 化合物1、2、3 和4 的结构式Fig.1 Structure of compound 1，2，3 and 4

4 讨论

本研究通过生物活性跟踪法结合现代分离纯化技术，发现枫杨乙醇提取物及其氯仿萃取部位有明显抑菌作用，而石油醚或乙酸乙酯部位抑菌作用较弱，正丁醇或水部位无抗菌作用;首次从氯仿部位和乙酸乙酯部位筛选出4 个高活性抗菌单体，分别为5-羟基-1，4-萘醌(1)、5-羟基-2-甲氧基-1，4-萘 醌(2)、2，6-二甲氧基-1，4-对苯醌(3)、没食子酸(4)。本研究采用化学结合生物活性追踪法得到的抗菌活性单体，与一般的化学方法分离得到的化学成分的方式有所区别，同时所有活性成分均为首次从枫杨中获得。

5-羟基-1，4-萘醌(1)又名胡桃醌，抗菌谱广，抗菌效价高，主要在对数期，通过破坏菌体的细胞壁或细胞膜结构抑制细菌生长［10］。2，6-二甲氧基-1，4-对苯醌(3)抗菌谱广，在很低浓度下即可杀灭多种致病性细菌、真菌［11］。没食子酸(4)对6 种常见食源性致病菌和腐败菌的最小抑菌浓度为0.125～4.000 mg/mL，主要抑制菌体在对数生长期的分裂［12］。除了本研究所筛选到的4 个高活性抗菌单体，笔者先前已从枫杨树皮筛选鉴定出另一个高活性抗菌单体5-羟基-2-乙氧基-1，4-萘醌［13］，经抗菌测定，发现该物质抗菌谱较广，对多种细菌、真菌有显著拮抗作用，抗菌活性强度近似于左氧氟沙星［14］。该物质与5-羟基-2-甲氧基-1，4-萘醌(2)在结构上只是取代基(乙氧基、甲氧基)的差异。

可见枫杨抗菌成分类别或化学结构母核丰富，其抗菌物质基础由一系列(目前发现5 个)的抗菌活性物质组成，它们的碳骨架分别属于苯醌(1 个)、萘醌(3 个)、苯甲酰(1 个)三类化学母核。

枫杨树皮外用抗菌用药历史悠久，疗效肯定;枫杨植物地域分布广，极易再生，资源优势明显。本研究及前期研究发现枫杨集3 类抗菌结构母核、5 个抗菌成分于一身，是一味难得的抗菌中药;多类别的抗菌单体，可能从多机理途径、多靶位点发挥抗菌疗效，为开发出不易产生耐药性的外用抗菌部位药提供理论基础。本研究揭示的多抗菌母核组成的枫杨抗菌物质基础，也为枫杨药材的质量标准制定奠定了基础。

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