UHPLC 法同时测定金银花中6 种有效成分的含量

韩永成，刘 伟，陈 宁，崔永霞，黄丽杰

河南中医学院分析测试中心，郑州 450008

金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb 的干燥花蕾或带初开的花［1］。金银花含有绿原酸、咖啡酸、异绿原酸、阿魏酸、木犀草苷、芦丁、金丝桃苷、忍冬苷、槲皮素等成分［2］。现代药理实验研究证明其具有广谱抗菌、解热消炎作用，相关文献报道较多［3-5］。

目前，同时测定金银花中有机酸和黄酮类含量的文献报道较少，且测定金银花中有效成分主要采用HPLC 法［1］，但未见UHPLC 法的研究报道。超高效技术与传统的采用5.0 μm 颗粒度的色谱柱填料的HPLC 技术相比能获更高的柱效，且在更宽的线速度范围内柱保持恒定，因而有利于提高流动相速度，缩短分析时间，提高分析通量;使新型液相色谱的峰容量、分析效率、灵敏度较常规HPLC 有了很大的提高，可为复杂体系的分离分析提供良好的平台［6］。2010 版《中国药典》仅以绿原酸和木犀草苷为指标评价金银花质量，为了更好地控制金银花的质量及综合评价金银花的整体质量，本实验研究UHPLC 法同时测定金银花中的绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C。

1 仪器与试药

Agilent1290 UHPLC 超高效液相色谱仪(1290二元梯度泵、1260DAD 检测器)(美国Agilent 公司);色谱乙腈(美国天地试剂公司);市售纯净水;其他试剂均为分析纯。绿原酸对照品(批号:110753-200212)，芦丁(批号:100080-200707)，木犀草苷(批号:111520-200201)购自中国药品生物制品检定所，含量≥98%;异绿原酸A(批号:MUST-09061601)，异绿原酸B(批号:MUST-09061602)，异绿原酸C(批号:MUST-09061603)均购自成都曼思特生物科技有限公司，含量均≥98%。实验所需药材，采自于不同产地的金银花，经河南中医学院董诚明教授鉴定为金银花:忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb 的干燥花蕾或带初开的花。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱Agilent ZORBAX RH C18(50 mm × 2.1 mm，1.8 μm)，流动相为0.2% 磷酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱程序:0～2 min，13% B;2～3.1 min，13%～25%B;3.1～8 min，25% B;流速0.2 mL/min，检测波长350 nm，柱温30 ℃，进样量0.5 μL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 对照品适量分别置50 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，制成绿原酸39.6 μg/mL、芦丁46.2μg/mL、木犀草苷40.0 μg/mL、异绿原酸A 44.6 μg/mL、异绿原酸B 38.9 μg/mL、异绿原酸C 36.8 μg/mL 的溶液;精密取40.0 μg/mL 木犀草苷、44.6 μg/mL 异绿原酸A、36.8 μg/mL 异绿原酸C 1mL 分别置10mL 容量瓶中，70%乙醇定容;分别取以上标品母液1mL 混合，作为混合对照品。密封存放于4 ℃冰箱中备用，临用时需用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为对照品溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取金银花粉末0.25 g，置具塞150 mL 锥形瓶中，精密加70%乙醇30 mL，超声(功率250W，频率35KHZ)提取45 min，放冷，抽滤，用70%乙醇洗涤滤纸，合并滤液，置50 mL 棕色容量瓶定容。临用时需用0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液，即得。

2.4 线性关系考察

分别取“2.2”项下的绿原酸39.6 μg/mL、芦丁46.2 μg/mL、木犀草苷4.0 μg/mL、异绿原A 4.5 μg/mL、异绿原酸B 38.9 μg/mL、异绿原酸C 3.7 μg/mL 标品溶液，分别以0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 μL 进样量进样，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积。以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果见表1。

表1 回归方程和线性范围Table 1 Regression equations and linear ranges of the 5 investigated components

2.5 精密度试验

取“2.2”混合对照品溶液，以0.5 μL 进样量，连续进样6 次，计算得绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 峰面积的RSD 分别为0.13%、0.14%、0.15%、0.20%、0.16%、0.18%，结果表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取封丘贾庄金银花样品，按“2.3”项下制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h 进样，按“2.1”项下方法测定峰面积，结果绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 峰面积的RSD分别为0.57%、0.42%、0.45%、0.51%、0.46%、0.37%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.7 重复性试验

取同一批金银花样品(封丘贾庄)精密称取0.25 g(6 份)，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下方法测定，测定样品中绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 的含量，测得质量分数的RSD 分别为为0.34%、0.42%、1.05%、0.87%、1.01%、1.12%，表明重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的金银花(封丘贾庄)6 份，精密称取0.125 g，精密加入一定量对照组分，其余按“2.3”项下方法制备样品，作为加样回收供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 的平均回 收 率 分 别 为 98.99%、98.90%、98.43%、96.88%、99.16%、97.35%;RSD 分别为0.49%、0.23%、0.30%、0.56%、0.35%，1.06%(n=6)，结果见表2。

表2 回收率试验结果(n=6)Table 2 Results for recovery tests (n=6)

注:样品加入46.2 μg/mL 芦丁标品溶液4.000 mL，加入量40.0 μg/mL 木犀草苷标品溶液0.475 mL，加入量44.6 μg/mL 异绿原酸A 标品溶液0.750 mL，挥干后再处理。Note:4.000 mL of rutin standard solution (46.2 μg/mL)，0.475 mL of luteoloside standard solution (40.0 μg/mL)and 0.750 mL of 3，5-O-dicaffeoylquinic acid standard solution (44.6 μg/mL)were added into the sample solution.Processed after volatilizing to dryness.

2.9 样品测定

取不同产地金银花样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算各样品中绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 的含量，结果见表3 和图1、2。

表3 不同产地金银花中绿原酸和木犀草苷含量测定结果(n=3，mg/g)Table 3 content determination results of chlorogenic acid and luteoloside(n=3，mg/g)

图1 混合标品(A)及金银花供试品(B)的UHPLC 色谱图Fig.1 UHPLC chromatograms of mixed standards (A)and L.japonica sample (B)

3 讨论

3.1 提取溶剂的考察

对于药材中绿原酸和木犀草苷的提取，2010 版《中国药典》金银花项下绿原酸提取采用50%甲醇，木犀草苷提取则采用70%乙醇，本试验采用50%乙醇、50%甲醇、70%乙醇、70%甲醇提取进行单因素考察，结果发现采用70%乙醇作为溶剂提取的绿原酸、木犀草苷及六种有效成分总含量较高。

3.2 流动相的考察

分别考察了甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸水不同比例的流动相系统进行梯度洗脱，结果表明采用乙腈-0.2%磷酸水进行梯度洗脱，分离度和峰型均较好。

3.3 检测波长的考察

2010 版《中国药典》绿原酸和木犀草苷分别以327、350 nm 为检测波长，而异绿原酸的最大吸收波长为330 nm，芦丁在350 nm 处有较大吸收。绿原酸在350 nm 处吸收值是327 nm 吸收值的80%左右，而木犀草苷在327 nm 处吸收值比350 nm 处低20%左右。由于金银花中绿原酸含量较木犀草苷及芦丁等成分的含量较高，在色谱图的3D 图谱中以上各有效成分在350 nm 处都有较好吸收，因此本实验选择350 nm 作为检测波长。

3.4 UHPLC 与HPLC 的比较

UHPLC 较HPLC 峰容量、灵敏度、分析速度和检测限都有了很大的提高。采用UHPLC，在8 min内完成对金银花中绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 含量测定，而HPLC测定其中的几个成分需要60 min 左右完成测试［7，8］。采用UHPLC 代替HPLC，在保证测定结果准确的前提下，提高了分析效率，节约了大量的分析时间，减少了溶剂的消耗，降低分析成本［9］。但UHPLC 的色谱柱柱子成本相对常规色谱柱较高。

3.5 结果分析

由测定结果可以看出，不同产地绿原酸和木犀草苷含量相差较大，绿原酸以新乡、封丘及平邑产地含量相对较高，而禹州和商丘的含量比较低;木犀草苷以新乡、封丘和平邑含量较高;有效成分的总含量也是以封丘和平邑的较高;所以可初步确定封丘和山东平邑产的金银花质量较好，可以以此产地为GAP 考察目标，分析其生长环境，以此规范种植金银花提高其质量。

本实验建立UHPLC 法同时检测金银花绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 的含量，在此色谱条件下所测成分分离完全，该方法操作简便，结果准确，分析速度快且重现性较好，可为金银花的质量控制研究提供新的分析方法和科学依据。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission (国家药典委员会).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (中华人民共和国药典).Beijing:China Medical Science Press，2010.Vol I，205.

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