荔枝核皂苷对小鼠学习记忆障碍的改善

叶红梅 钟春燕 吕俊华*

(1广州市中医医院药剂科，广东广州510130;2暨南大学药学院药理教研室，广东广州510632)

记忆功能减退是认知障碍的标志症状，也是老年性痴呆的早期症状和主要特征。随着人口老龄化和痴呆患病率的逐年增加，寻找有效的延缓和改善痴呆的药物和方法显得尤为重要。中药荔枝核具有行气散结，祛寒止痛之功效，荔枝核皂苷有归肝肾经、散寒行气的功效，能调节人体糖、脂代谢、抗氧化和增强胰岛素敏感性的作用，对RAGE的表达有一定影响。大量的资料事实证明:人体衰老存在学习记忆衰退和认知障碍。动物实验研究也表明，衰老与认知功能障碍密切相关［1-2］。但关于荔枝核改善学习记忆障碍方面未见报道;本实验将进一步研究荔枝核皂苷对D-半乳糖致小鼠学习记忆障碍的改善作用与脑内单胺类神经递质及代谢产物作用及其可能的作用机制，为其用于改善老年性记忆障碍，延缓痴呆等相关性疾病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料原料来源

1.1.1 荔枝核颗粒的制备 荔枝核经广东省农科院果树所荔枝研究室的专家鉴定的产自花都市花东镇九一村王木海荔枝园的淮枝核作原材料。取荔枝核洗净，破核后投料，加水煎煮2次，第1次加药材用8倍的水，煎煮2 h，第2次加药材用7倍的水，煎煮2 h，合并滤液，过沪，滤液减压浓缩至相对密度为1.25～1.30(60 ～65 ℃)的浸膏，检验合格，取以上浸膏，蔗糖粉和药用糊精混匀制备，过12目筛网制粒，烘干，颗粒检验合格后分装5 g/包，(广东一方制药有限公司，生产批号:1101076)。

1.1.2 动物 2月龄昆明种小鼠50只，雌雄各半，体质量(30±2)g，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号:SCXK2009-0002，粤监证字2009AO19。

1.1.3 药品及试剂 D-半乳糖(Sigma公司，批号:119k0103);石杉碱甲(南京泽朗医药科技有限公司生产，批号zl20101205);人神经氨酸酶 (NA批号:100050-201406);多巴胺(DA批号:100070-211405);5-羟色胺(5-HT批号:111656-2001101);5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA批号:140737-2011501);二羟苯乙酸(DOPAC批号:10130-201502);均购自中国药品生物制品检定所;水为超纯水，乙腈为色谱纯(德国默克公司)，其余试剂均为分析纯。

1.1.4 仪器 Morris水迷宫(上海吉量有限公司);ES-2000型电子天平(沈阳龙腾电子称量仪器有限公司);SMART video-tracking system(Panla公司);紫外分光光度计(美国珀金埃尔默公司)。库仑阵列电化学高效液相色谱仪［Model 5600A-16通道检测器(美国 ESA公司)，Model 582 solvent Delivery System，Model 542自动进样器，CoularrayWin工作站］，Dionex Tcc100型柱温箱(美国戴安公司);Thermo D-37520型高速冷冻离心机(德国Heraeus公司);pHS-25型pH计(上海精密科学仪器有限公司);GenPure超纯水(德国TKA公司);KQ 500型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，功率500 W，频率40 kHz);3 K超滤管(PALL公司);BP211D电子天平 (德国Sartorious);佳美 SK-快速混匀器(江苏金坛市佳美仪器厂);玻璃匀浆器。

1.2 实验方法

1.2.1 学习记忆障碍小鼠模型的建立［3］小鼠皮下(sc)注射 D-半乳糖(500 mg/kg·d)连续8周，并以水迷宫测试确定学习记忆障碍模型的成立。注射容量为10 mL/kg体质量。

1.2.2 动物分组及给药 小鼠按体质量随机分为5组:正常对照组，模型对照组，石杉碱甲组(0.4 mg/kg)，荔枝核皂苷(15 g/kg)和高剂量组(60 g/kg)。除正常对照组外，上述各组动物均给予D-半乳糖(500 mg/kg·d)造模，并于造模第5周开始给予上述药物灌胃，连续给药4周，给药容积同上。

1.2.3 Morris水迷宫测试［4］水迷宫直径120 cm，高50 cm，站台直径9 cm，高30 cm，水面高于站台1 cm，水中加入适量墨汁，使小鼠看不到平台及池底。水池温度维持在22～24°C。实验主要分为两部分:一是定位航行实验，即设置平台，每天灌胃后1 h，每只小鼠训练4次，按东、西 、南、北4个方向入水，小鼠面对池壁投入水中，记录小鼠自入水到稳定爬上平台所需时间(即逃避潜伏期)。小鼠爬上站台后让其在上站立15 s，若入水后60 s内未能找到站台并站立15s，可将动物放于站台站立15 s后拿下来，休息30～60 s后进行下一次训练。二是空间探索实验，即撤除平台，观察小鼠在一定时间(30 s)内穿越原平台次数和停留原平台所在象限时间百分比。从第7个实验日开始，进行空间探索实验，记录小鼠在原来位置站台的象限逗留的时间及站台穿越次数。

1.2.4 荔枝核皂苷对D-半乳糖诱致小鼠学习记忆障碍白天自主行为的影响［4］实验装置为 15 cm×30 cm ×30 cm的箱 ，4周为黑色塑料板 ，箱底铺以铜栅，铜丝直径为2 mm，间距为5 mm，电流强度由一个可调变压器控制 ，通以36V电流 ，箱内右后侧放置一个高和直径均为415 cm的橡皮垫作为大鼠逃避电击的安全区。将小鼠放入箱中自由活动3 DOPAC和NA检测按说明书进行测定。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 荔枝核皂苷改善D-半乳糖诱致小鼠学习记忆障碍的作用

模型组动物定向航行潜伏期明显延长(P＜0.01);空间探索实验中，在原象限停留时间和站台穿越次数明显减少(P＜0.01);荔枝核皂苷和石杉碱甲处理后，定向航行潜伏期明显缩短(P＜0.01)，而在原象限停留时间与模型组比较略有增加，差异无统计学意义(P＞0.05)，但低剂量荔枝核组明显增加站台穿越次数明显增加(P＜0.05)见表1。

2.2 荔枝核皂苷对D-半乳糖诱致小鼠学习记忆障碍白天自主行为的影响

与正常对照组相比，模型对照组小鼠白天自主行为平均活动速度变慢，休息时间增加，快运动时间做短，忙运动时间延长(P ＜0.05，P ＜0.01)。荔枝核处理后，平均活动速度略有增加，但与模型组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，但可明显缩短休息时间和增加快运动时间(P＜0.01)。见表2。

2.3 荔枝核皂苷对D-半乳糖诱致小鼠学习记忆障碍夜间自主行为的影响

与正常对照组相比，模型组夜间平均速度明显减少，休息时间明显延长，快运动时间明显缩短(P＜0.01)。与模型对照组相比，荔枝核皂苷处理后，可增加平均速度，尤其是低剂量组作用明显(P＜0.01)，而对休息时间和快慢运动影响较小。见表3。min，熟悉环境，然后箱底通以电流 ，其正常反应是跳上平台以躲避伤害性刺激。记录自放入至第1次跳下平台受电击的时间为潜伏期及5 min内跳下平台受电击的次数为错误数，作为学习成绩。24 h后，再将鼠置于平台上依上法记录作为记忆缩短休息时间和增加快运动成绩。

1.2.5 荔枝核皂苷对D-半乳糖诱致小鼠学习记忆障碍夜间自主行为的影响［4］实验装置为 15 cm×30 cm ×30 cm的箱 ，4周为黑色塑料板 ，箱底铺以铜栅，铜丝直径为2 mm，间距为5 mm，电流强度由一个可调变压器控制 ，通以36V电流 ，箱内右后侧放置一个高和直径均为415 cm的橡皮垫作为大鼠逃避电击的安全区。实验夜间进行自主行为将小鼠放入箱中自由活动3 min，熟悉环境，然后箱底通以电流，其正常反应是跳上平台以躲避伤害性刺激。记录自放入至第1次跳下平台受电击的时间为潜伏期及5 min内跳下平台受电击的次数为错误数，作为学习成绩。24 h后，再将鼠置于平台上依上法记录作为记忆夜间进行自主行为缩短休息时间和增加快运动成绩。

1.2.6 荔枝核皂苷对D-半乳糖诱致小鼠学习记忆障碍的改善作用的抗糖基化机制［5］处死小鼠获取血清及脑组织，称大脑按1∶9加入冷生理盐水制成浓度为10%的小鼠脑组织匀浆液，按晚期糖基化产物、血清果糖胺、血清糖化血红蛋白水平和AGEs的形成及脑组织内的糖基化产物含量;检测按试剂盒说明书进行操作测定。

1.2.7 荔枝核皂苷D-半乳糖诱致小鼠学习记忆障碍的改善作用与脑内单胺类神经递质的关系［6］采用高效液相库仑阵列电化学检测系统检测小鼠脑内单胺类神经递质的含量变化，称小鼠大脑按1∶9加入冷生理盐水匀浆，按脑内5-HT、5-HIAA、DA、

表1 荔枝核提取物对D-半乳糖致小鼠学习记忆障碍的影响(±s，n=10)

表1 荔枝核提取物对D-半乳糖致小鼠学习记忆障碍的影响(±s，n=10)

注:与正常对照组比较:a P＜0.01;与模型组比较:b P＜0.05

组别 剂量(g/kg·d)定向航行潜伏期(s)空间探索原象限停留时间(s) 站台穿越(次)24.36 ±7.51 48.28 ±8.02 1.90 ±0.88模型组 － 44.63±4.76a 33.76±5.37a 0.70±0.48a石杉碱甲组 0.4 mg 37.46 ±9.23b 35.20 ±4.71 0.90 ±0.57b荔枝核(高) 60 40.30 ±7.21b 34.09 ±7.88 0.80 ±0.35荔枝核(低) 15 35.50 ±7.76b 37.48 ±5.29 1.00 ±0.67正常对照组 －b

2.4 荔枝核皂苷对D-半乳糖诱致小鼠学习记忆障碍的改善作用的抗糖基化机制

模型组大鼠的AR活性明显高于正常组(P＜0.01);荔枝核皂苷给药后，均明显降低D-半乳糖处理后引起的AR活性增高(P＜0.05)。同时，荔枝核皂苷高、中剂量组明显降低晚期糖基化产物，如血清果糖胺、血清糖化血红蛋白水平和AGEs的形成及脑组织内的糖基化产物(P＜0.05)。见表4。

2.5 荔枝核皂苷D-半乳糖诱致小鼠学习记忆障碍的改善作用与脑内单胺类神经递质的关系

采用高效液相库仑阵列电化学检测系统检测小鼠脑内单胺类神经递质的含量变化，由表5可见，模型组与正常对照组相比脑内5-HT、5-HIAA、DA、DOPAC和NA含量差异(P＞0.05)。各给药组与模型对照组相比，上述单胺类递质含量亦无统计学意义(P ＞0.05);见表5。

表2 荔枝核提取物对D半乳糖诱致学习记忆障碍小鼠白天自主活动的影响(¯x±s，n=10)

表3 荔枝核皂苷对D半乳糖诱致学习记忆障碍小鼠夜间自主活动的影响(¯x±s，n=10)

表4 荔枝核提取物对D-半乳糖诱致小鼠学习记忆障碍时的AR活性和糖化产物的影响(¯x±s，n=10)

表5 荔枝核皂苷对D-半乳糖诱致学习记忆障碍小鼠脑内单胺类神经递质的影响(¯x±s，n=10)

3 讨论

老年性痴呆(A lzheimer氏病，AD)约占老年期痴呆的50%，记忆力减退和人格改变是本病最早出现的症状。近年来，随着对记忆障碍的脑生化机理的研究，认为其主要与中枢神经递质代谢有关，且累及多种神经递质［7］。至于AD的脑内胆碱能改变已成定论。AD患病与神经元的退化、死亡、胆碱能功能衰竭密切相关。应用胆碱酯酶抑制剂而提升胆碱能功能可取得最为有效的对症治疗效果［8］。

本研究在D-半乳糖致衰老的基础上，行侧脑室注入Aβ造成 AD模型小鼠，使其学习记忆变化及病理变化与AD更为相似，并以此为基础，进一步研究荔枝核提取物对AD的防治作用。Morgon［9］等5-羟色胺:5-羟色胺(5-HT)是维持正常智能的重要递质，与5-羟色胺能系统密切相关的是中逢核。以前认为5-HT及其代谢产物5-吲哚乙酸未见有与年龄相关的变化，中逢核细胞脱落不严重。后来日本学者发现5-HT虽对记忆过程本身无效，但在动物学习前1h给与5-HT或在学习后海马区注射5-HT，均可引起记忆障碍。近年来研究发现AD患者5-HT系统也严重损害，表现为5-HT和5-羟吲哚乙酸浓度下降，其受体结合点减少;发现AD病人与正常人相比5-HT浓度下降受体数量减少。

本研究采用多种行为药理学方法检测由所致记忆障碍小鼠及D-半乳糖动物模型小鼠的学习记忆能力，实验结果可证明了荔枝核皂苷对记忆获得、记忆巩固及记忆再现障碍有明确的改善记忆功能，并对D-半乳糖所致衰老小鼠所致痴呆模型小鼠的学习记忆低下亦有显著的作用，荔枝核皂苷明显改善模型小鼠学习和记忆能力;并证实了荔枝核提取物对小鼠白天自主行为的平均活动速度略有增加，但与模型组比较无显著差异，可明显缩短休息时间和增加快运动时间。而夜间自主行为，可增加平均速度，尤其是低剂量组作用更明显;而对休息时间和快慢运动影响较小。各给药组与模型对照组相比单胺类递质含量亦无明显变化。因而从药效学角度看来，荔枝核提取物具有改善D-半乳糖诱致小鼠学习记忆障碍的作用;其作用可能与其减少抑制对脑神经细胞的损伤作用有关，但其确切的作用机理有待于研究。

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