参附强心丸对腺嘌呤致肾阳虚大鼠温阳利水作用及机制研究Δ

王 梓 ，张 浩，郝 迪，李 旭，袁 玲，王 蕾#(.天津市医药科学研究所心脑血管药物研发中心，天津 30000;.天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂生产供应部，天津 300457)

参附强心丸是天津中新药业集团股份有公司达仁堂制药厂研制，该药根据“己椒苈黄丸”和“参附汤”化裁而来，具有益气助阳，强心利水的功效，临床治疗慢性心力衰竭引起的心悸、气短、胸闷喘促、面肢浮肿等疗效较好。本研究旨在运用药理学试验的方法，观察参附强心丸对慢性肾衰大鼠的温阳利水作用，揭示参附强心丸的益气、助阳、利水的作用机制，现报告如下。

1 材料

1.1 动物

Wistar 大鼠，雄性，体质量260 ～280 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号:SCXK(京)2006-0009。

1.2 药物

受试药物:参附强心丸，由天津中新药业集团股份有公司达仁堂制药厂提供，棕色粉末，规格为1 g 生药/g 药粉，批准文号:zj001。阳性对照药:地塞米松片，天津力生制药股份有限公司，规格:0.75 mg/片，批准文号:1012029。造模药物:腺嘌呤C5H5N5，购自上海润捷化学试剂有限公司，纯度≥98.0%，批号:101101。使用前用1.0%羧甲基纤维素钠配制成2%腺嘌呤混悬液。

1.3 仪器

双探头放射免疫γ 计数器(SN-697);PL203 精密电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司制造);电子温度计;日本AU-640 型奥林巴斯全自动生化分析仪;日本OLYMPUS B071型显微摄影器材;IDA-2000 高清晰度数码显微图像分析系统。

2 方法

2.1 造模方法

采用“单肾切除合并腺嘌呤灌胃法”制备大鼠慢性肾衰竭模型:选用雄性Wistar 大鼠，右肾切除术后1 周，以200 mg/(kg·d)腺嘌呤混悬液灌胃［1-3］，连续14 d。假手术对照组仅对大鼠皮肤和肌肉进行切开、缝合操作，不切除肾脏。术后1 周对大鼠灌胃1.0%羧甲基纤维素钠盐(sodium carboxymethyl cellulose，CMC)，连续应用14 d。

2.2 动物分组及给药方法

术后1 周，将存活的大鼠根据体质量按随机数字表法分为模型对照组、地塞米松对照组(0.2 mg/kg，相当于临床人用计量的10 倍)、参附强心丸2.14、1.07、0.54 g 生药/kg 剂量组(分别相当于临床人用剂量的20、10、5 倍)，灌胃体积10 ml/kg，1 日1 次，共3 周。假手术组和模型对照组大鼠灌胃同体积纯净水。

2.3 观察方法及指标

观察大鼠体质量、皮毛、活动等一般生存情况。试验结束时，对大鼠进行腹主动脉采血，全自动生化仪测定血清尿素氮(UREA)和肌酐(CREA)含量。对大鼠进行腹主动脉采血，放免法测定血中血管紧张素Ⅱ(AngII)和醛固酮(ALD)含量。试验结束时，对大鼠进行腹主动脉采血，测定血清中钾(K+)、钠(Na+)、氯(Cl-)、钙(Ca2+)、磷(P3+)含量。使用电子温度计测定大鼠肛温。取血结束后，将肾衰大鼠的左肾取出，称取湿质量，计算肾体比，肾体比(g/100 g BW)=肾脏质量(g)/体质量(g)×100。将大鼠称质量后的左肾，用刀片在矢状面剖开以利于固定，置入12%甲醛中，制作石蜡切片，常规HE 染色，光学显微镜下观察肾组织形态学改变。将肾组织损伤病变程度分级为5 级，用秩和检验进行统计学比较。

2.4 统计学方法

本研究中所得数据经SPSS 17.0 统计软件多组间单因素方差分析进行统计，P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠一般生存状态比较

肉眼观察模型对照组大鼠出现皮毛稀疏，蜷卧少动，消瘦等衰弱体征;参附强心丸3 个剂量组大鼠一般状况较模型对照组明显好转，皮毛致密光亮。

3.2 各组大鼠肾功能及神经内分泌激素指标比较

模型对照组大鼠的UREA、CREA 含量明显升高;参附强心丸3 个剂量组和地塞米松对照组大鼠的UREA、CREA 水平均明显低于模型对照组;模型对照组和参附强心受试组大鼠的AngⅡ显著低于假手术对照组，ALD 明显高于假手术对照组;参附强心丸2.14 g/kg 组和地塞米松对照组大鼠的ALD 较模型对照组明显降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

3.3 各组大鼠不同电解质指标比较

模型对照组大鼠呈高钾、低钙、高磷血症;参附强心丸2.14 g/kg 组大鼠可纠正低血钙症;参附强心丸3 个剂量组大鼠均能纠正高磷血症;地塞米松对照组大鼠可纠正CRF 大鼠高钾、低钙、高磷血症，使血钾、血钙、血磷接近正常水平，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

3.4 各组大鼠体温、肾脏质量及肾体比情况比较

模型对照组大鼠体温明显降低，差异有统计学意义(P＜0.001)，由于肾衰竭使体温调节功能异常导致体温过低，基础代谢率下降;参附强心丸各剂量组未见体温回升的作用;地塞米松组体温过低，可能与糖皮质激素对体温调节中枢的抑制作用有关［4］。

表1 各组大鼠肾功能及神经内分泌激素指标比较±s)Tab 1 Comparison of kidney function and neuroendocrine hormone indexes of rats in different groups(¯x±s)

表1 各组大鼠肾功能及神经内分泌激素指标比较±s)Tab 1 Comparison of kidney function and neuroendocrine hormone indexes of rats in different groups(¯x±s)

注:与假手术对照组比较，△P ＜0.05，* P ＜0.001;与模型对照组比较，★P ＜0.05，#P ＜0.01，※P ＜0.001Note:vs.Sham operation control group，△P ＜0.05，* P ＜0.001;vs.model control★P ＜0.05，#P ＜0.01，※P ＜0.001

组别肾功能 神经内分泌激素UREA/(mmol/L) CREA/(umol/L) AngⅡ/(pg/ml) ALD/(ng/ml)假手术对照组(n=10) 5.90±0.55 23.94±2.32 1 862.123±95.253 0.265±0.058模型对照组(n=10) 40.48±8.15* 199.92±52.31* 760.802±412.678* 0.551±0.188△参附强心丸2.14 g 生药/kg(n=10) 27.99±7.77# 122.55±37.26# 610.990±399.512 0.342±0.122★参附强心丸1.07 g 生药/kg(n=10) 27.87±6.14# 130.05±27.53# 405.727±271.834 0.357±0.125参附强心丸0.54 g 生药/kg(n=10) 27.36±6.90# 138.90±51.62# 492.861±461.638 0.532±0.195地塞米松0.2 mg/kg(n=10) 24.24±5.42※ 79.14±16.74※ 938.768±642.430★ 0.227±0.082※

表2 各组大鼠不同电解质指标比较(¯x±s)Tab 2 Comparison of various electrolyte indexes of rats in different groups(¯x±s)

模型对照组大鼠肾脏质量明显大于假手术对照组，差异有统计学意义(P＜0.001);参附强心各剂量组大鼠肾脏质量较模型对照组均降低，其中2.14 g·kg-1组与模型对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05);地塞米松对照组大鼠肾脏质量降低最明显，差异有统计学意义(P＜0.001)，但由于该组大鼠体质量明显降低，因此，其与模型对照组的差异无统计学意义(P＞0.05);参附强心丸2.14 g·kg-1组大鼠不但肾脏质量明显降低，该组大鼠体质量增长趋势亦得以改善，因此，计算所得肾体比亦明显低于模型对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)，见表3。

表3 各组大鼠体温、肾脏质量及肾体比情况比较(¯x±s)Tab 3 Comparison of body temperature，ratio of the kidney weight versus kidney volume of rats in different groups(¯x±s)

3.5 各组大鼠肾组织形态学情况比较

肉眼观察可见，正常对照组大鼠肾脏大小、硬度、颜色均正常，表面光滑，肾包膜容易剥离，切面皮髓质分界清楚，皮质无增厚现象。模型对照组大鼠肾脏体积明显增大，肾脏表面成灰白色颗粒状，为典型“大白肾”表征，肾包膜与肾实质粘连不易剥离，切面皮髓质分界不清。参附强心各剂量组和地塞米松对照组大鼠肾脏体积明显小于模型对照组，且苍白程度较轻，见图1。

图1 肉眼所见模型组大鼠肾脏改变图Fig 1 The naked eye can see model group rats kidney change figure

肾脏病理学检查结果表明，假手术对照组大鼠肾组织结构无异常，被膜光滑，皮髓质结构清楚，肾小球体积未见缩小或肥大，数目未见减少，肾小管上皮细胞未见变性、坏死或脱落，管腔中未见管型及结石，肾间质未见炎细胞浸润及纤维组织增生。模型对照组大鼠病变明显，肾体积增大显著，多数肾小管高度扩张，上皮细胞萎缩，肾小球数目减少，部分纤维化，间质可见大量炎细胞浸润，部分肾组织充血、水肿及纤维组织增生，正常肾组织仅见小岛状分布或不见，见图2。参附强心丸2.14、1.07、0.54 g/kg 剂量组与模型组大鼠相比，病变不同程度地明显减轻，肾体积增大有所控制，扩张的肾小管减少，间质炎细胞浸润、肾组织充血、水肿及纤维组织增生均呈不同程度减轻，正常肾组织所占比例增多，其中以2.14、1.07 g/kg 剂量组更为显著，见图3。地塞米松组与模型组大鼠比较，病变减轻最明显，肾小管扩张、间质炎细胞浸润、肾组织充血、水肿及纤维组织增生均明显减轻，每视野能见到更多的正常肾组织，见图4。

图2 模型对照组肾组织病理图(×100)Fig 2 Pathology of kidney tissue in mode group(×100)

图3 2.14 g 生药/kg 组肾组织病理图(×100)Fig 3 Pathology of kidney tissue in dosage group with 2.14 g/kg Shenfuqiangxin pills in crude drug(×100)

4 讨论

4.1 模型建立

图4 地塞米松对照组肾组织病理图(×100)Fig 4 Pathology of kidney tissue in dexamethasone group(×100)

中医对慢性心力衰竭的病因病机概括为心肾阳虚为本，血瘀水停为标。在对参附强心丸进行药理试验设计时，在建立慢性心力衰竭的动物模型之外，亦建立相应的、能体现心阳虚、肾阳虚、乃至阳虚水泛的中医病因模型，观察其温阳益气、利水化饮的作用［5］。本试验选用“单肾切除合并腺嘌呤灌胃法”制备CRF 模型，高浓度腺嘌呤通过黄嘌呤氧化作用变为极难溶于水的2.8-二羟基嘌呤，其沉积于肾小管进而阻塞肾小管，抑制氮质化合物的排泄，该方法造成大鼠与人类CRF 较类似的代谢异常，包括氮质血症、胍类化合物的蓄积、氨基酸代谢异常、电解质代谢紊乱和内分泌异常，肾近曲小管、部分远曲小管及肾小球受损，肾脏呈大白肾甚至肾固缩，最终引起肾功能衰竭［3-8］。大鼠经单侧肾切除术后，由于留存肾工作负荷增加，导致肾脏呈代偿性生长［9］，可促进腺嘌呤导致肾衰竭的病理发展，缩短模型制备周期。本试验观察到大鼠应用200 mg/kg腺嘌呤灌胃，1 日1 次，连续14 d 后，大鼠呈日益消瘦，蜷缩拱背，精神萎顿，体毛脱落，血UREA、CREA 明显升高等肾功能异常;血中K+、P3+水平明显升高，血Ca2+明显降低等电解质异常。同时肾脏质量和肾脏指数均明显增加，肾脏表面满布灰白色颗粒，光镜下观察，肾组织内大量二羟基腺嘌呤结晶沉积，光镜下可见模型对照组病变明显，肾小管高度扩张，上皮细胞萎缩，肾小球数目减少，部分纤维化。

4.2 参附强心作用机制

本试验结果表明，参附强心丸对CRF 大鼠治疗作用明显，其作用机制为:(1)温煦阳气:参附强心丸干预治疗组较模型对照组大鼠肾阳虚症状明显改善，体态舒展、皮毛光亮顺滑、自主活动正常，该组大鼠体征为温煦滋养状态，可表明参附强心具有益气温阳之功。(2)生化指标的改善:中医肾阳虚在临床检验指标的体现之一，即为CREA、UREA 的异常［10］。中药对肾阳虚的治疗作用，可量化地体现在对生化指标的改善方面，3 个剂量组大鼠的参附强心丸均可使CRF 异常升高的CREA、UREA 明显下降，表明该药对肾脏滤过功能的修复作用。(3)纠正水钠潴留:“水钠潴留”用中医病机可描述为“水饮内停”“阳虚水泛”，临床最明显的体征为水肿，但动物试验对水肿的观察欠直观。ALD 可反映机体水钠潴留状态［11］，是观察药物利水的客观指标之一。参附强心丸2.14 g/kg 可明显降低肾阳虚大鼠ALD 含量，充分说明其利水的确切功效。(4)纠正电解质紊乱:参附强心丸对高钾、低钙、高磷血症有明显纠正功效。钾的平衡失调会导致严重并发症，高血钾症可致严重的心律失常甚至心搏骤停，高血磷和低钙血症可引起继发性甲状旁腺功能亢进，引起骨质脱钙、骨软化、纤维性骨炎等肾性骨病，因此对高钾、低钙、高磷血症的及时纠正具有重要意义。(5)对肾脏组织结构的改善:参附强心丸可使病变的肾脏组织结构得以修复，使扩张肾小管减少，炎性、充血、水肿、增生等病理变化均减轻。

4.3 AngⅡ指标的偏低

AngⅡ指标数据表明，本试验中采取的“单侧肾切除合并灌胃腺嘌呤”法制备的CRF 大鼠AngⅡ并未升高，反而明显降低，其原因可能是由于只有一侧残留病肾，慢性肾衰造成大鼠机体钠和水排出降低，钠潴留又使血容量扩张。而同时肾内压并不低于原有水平，因而肾素分泌不增加［12］。因此，在血容量增加的条件下，大鼠血浆内肾素值则相比之下低于正常，相应的由其转换的AngⅡ的数值亦低于正常。这与临床CRF 的AngⅡ不一致［13］。有文献报道，腺嘌呤150 mg/kg 应用4 周后，大鼠血浆AngⅡ和肾素均降低，故“单肾切除合并腺嘌呤灌胃法”制备CRF 模型在RAAS 系统的相关机制研究中有一些不太合适［14］。因此，今后在进行CRF 研究时，需对动物模型做以下优化:(1)选用化学药物造模时，要充分考虑该类化学物质导致的生化指标变化特点。(2)对试验动物选用适当的合并手术术式，如合并肾下腹主动脉缺血再灌术等［16］，争取在较短时间内实现心肾功能的共损、互损，缩短研究周期，并相应增加心肾损伤程度，高度模拟临床心肾综合征的病变特点。

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