顶空固相微萃取分析金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物的条件优化

（西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041）

顶空固相微萃取分析金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物的条件优化

史 辉，唐俊妮，陈 娟*，王 琼

（西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041）

采用65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙基苯（polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/DVB）、75 μm碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（carboxen/polydimethylsiloxane，CAR/PDMS）萃取头和50/30 μm二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取头，20、30 min和40 min 3 种萃取时间，50、65 ℃和80 ℃ 3 种萃取温度，分别对金黄色葡萄球菌胰蛋白胨大豆肉汤（tryptone soy broth，TSB）培养物的挥发性代谢产物进行萃取，经气相色谱-质谱检测，以建立适宜于金黄色葡萄球菌挥发性代谢物的萃取分析方法。结果表明，50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头能更好地满足各类化合物的萃取需要，获得更加全面的化合物信息，并且在萃取温度80 ℃条件下萃取30 min，得到的金黄色葡萄球菌挥发性代谢物的数量和响应强度较高。因此，萃取金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物的最适条件为：50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头、萃取温度80 ℃、萃取时间30 min。在该萃取条件下，检测出金黄色葡萄球菌在TSB中产生的主要挥发性物质为乙醇、1-癸醇、3-羟基-2-丁酮、丙酮、乙酸、苯甲醇、3-甲基-1-丁醇、吲哚、1-辛醇和正辛酸等。该萃取方法的建立可为细菌挥发性代谢产物的分析提供参考。

金黄色葡萄球菌；挥发性代谢产物；萃取条件；优化；顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用

细菌挥发性代谢产物是细菌代谢产物的重要组成部分，与细菌生命活动和细菌生长数量密切关联，是细菌与周围各种生物进行交流的重要信息素[1]。大多数细菌释放的挥发性代谢物都具有微生物种属特异性，意味着在某些情况下，挥发性特征或某些典型化合物能够作为检测和鉴别细菌的生物标志[2-3]。在临床医学上，细菌挥发性代谢产物作为一种新的检测靶标，成为了诊断细菌感染的有效方法[4-5]。近年来，基于挥发性化合物分析的气味指纹技术在食品中的应用越来越活跃。食品营养丰富，是微生物生长的良好培养基，容易受微生物污染，其次级代谢产物会产生特定的挥发性气味物质，基于这点可利用气味指纹技术来检测食品中的微生物[6]。金伟平等[7]运用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（headspace solid phase micro-extraction gas chromatography-mass spectroscopy，HS-SPME-GC-MS）联用技术对单增李斯特菌污染的冷藏牛肉所产生的挥发性物质进行分析，寻找到单增李斯特菌污染牛肉的特征性气味物质包括苯甲醛、二叔丁基对甲酚和十六烷。Holm等[8]也采用HSSPME-GC-MS技术对污染了热杀索丝菌、浅黄金色单胞菌和肉杆菌的干腊肠的挥发性物质进行了分析，发现二乙酰、3-羟基-2-丁酮、2-（或3-）甲基丁醇、2-（或3-）甲基丁醛和2-甲基丙醇等物质与干腊肠的腐败性感官指标紧密相关。Tait等[9]通过β-葡萄糖苷酶和马尿酸酶水解底物产生2-硝基苯酚和3-氟苯胺的方式，经HS-SPMEGC-MS检测牛奶是否受到单核增生李斯特菌的污染，方法的检测限达到1×102～1.5×102CFU/mL牛奶（过夜培养之前）。这些报道都是应用气味指纹技术检测食品中污染微生物的探索性研究。由于食品中微生物种类复杂，并且食品基质不同于简单的肉汤培养基，因此，拟通过气味特征检测食品中污染的微生物需要做大量的研究工作，包括全面分析食品中目标菌和背景菌各自的挥发性物质，目标菌和背景菌相互作用的挥发性物质，以及细菌生长情况与挥发性物质产生情况的相关性等。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种重要的机会致病菌，可引起人和动物的多种疾病，如心内膜炎、骨髓炎、关节炎和奶牛乳房炎等，它是社区和医院感染疾病中发病率和死亡率最高的病原菌[10]。对于食品安全而言，金黄色葡萄球菌引起的食源性疾病据估计在美国每年可暴发241 000 例[11]。我国由细菌引起的食物中毒事件中，由金黄色葡萄球菌污染的食物比例可占到32.5%[12]。目前，检测金黄色葡萄球菌的方法主要为传统培养法和基于分子生物学的聚合酶链式反应方法。有关金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物的研究不多，已有文献[13-14]报道了金黄色葡萄球菌在肉汤培养基中生长所产生的挥发性物质，以及耐受型和敏感型甲氧西林金黄色葡萄球菌肉汤培养物挥发性代谢产物之间的差异[15]等，但由于采用的菌株、培养基质和分析条件等方面的差异，目前关于应用气味指纹技术检测金黄色葡萄球菌的方法还有待详细探索。

SPME是近年来应用较为广泛的一种样品前处理技术，具有萃取、浓缩和进样于一体、操作简便、灵活和灵敏度高等特点[16]。SPME与GC-MS联用结合形成HSSPME-GC-MS分析技术，该技术是分析细菌挥发性代谢产物的主要方法之一[17]。萃取头的选择与萃取条件的优化是影响挥发性代谢物分析的关键。然而，目前仅见少量文献[15,18]报道了萃取方式对细菌挥发性代谢产物萃取效果的影响。本研究采用不同的萃取头、萃取温度和萃取时间对金黄色葡萄球菌在胰蛋白胨大豆肉汤（tryptone soy broth，TSB）培养物的挥发性代谢物进行萃取，经GC-MS方法检测。通过比较不同萃取条件对金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物的萃取差异，确定最适宜的萃取条件，使得GC-MS分析检测获得的信息更全面，化合物在质谱中的响应强度更高。本实验对金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物分析方法的研究将为气味指纹技术在食品微生物检测技术中的应用提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金黄色葡萄球菌菌株S. aureus ATCC 6538由西南民族大学生命科学与技术学院实验室保存；TSB 杭州微生物试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Trace DSQ型GC-MS联用仪（配Triplus自动进样器） 美国Thermo公司；65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙基苯（polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/ DVB）萃取头、50/30 μm二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取头和75 μm碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（carboxen/polydimethylsiloxane，CAR/PDMS）萃取头 美国Supelco公司；MOF-4086S低温冰箱、MLS-3020高压蒸汽灭菌锅 日本三洋公司；SW-CJ-1F超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；HZQ-F160振荡培养箱 太仓市实验设备厂。

1.3 方法

1.3.1 细菌培养物的制备

吸取金黄色葡萄球菌贮藏菌液50 μL接种入6 mL TSB培养基中，于37 ℃，150 r/min条件下培养16 h。再吸取金黄色葡萄球菌的新鲜培养物接入150 mL TSB中，使初始接种量为100～200 CFU/mL，于37 ℃，150 r/min条件下培养12～14 h，进入对数生长后期。吸取该培养物5 mL转入20 mL顶空瓶内，同时加入2 g氯化钠，加盖密封，作为测试样品。

1.3.2 萃取实验

在萃取温度80 ℃、萃取时间30 min条件下，分别采用65 μm PDMS/DVB萃取头、75 μm CAR/PDMS萃取头和50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头进行萃取。重复3 次。

采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，在萃取时间30 min条件下，分别采用50、65 ℃和80 ℃ 3 种萃取温度进行萃取。重复3 次。

采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，在萃取温度80 ℃条件下，分别采用20、30 min和40 min 3 种萃取时间进行萃取。重复3 次。

在优化得到的最适萃取条件下，测定未接种金黄色葡萄球菌的TSB培养基，作为空白对照。

1.3.3 分析条件

GC条件：HP-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；不分流模式，不分流1 min之后分流比为50∶1；流速1 mL/min；升温程序：40 ℃保持3 min，以10 ℃/min升温至280 ℃并保持3 min；载气为99.999%氦气；进样口温度230 ℃；解吸时间2 min。

MS条件：电子电离源；电子能量70 eV；离子源温度250 ℃；传输线温度280 ℃；全扫描模式；质量扫描范围40～500 u。

1.3.4 定性与定量

MS结果经计算机自动检索（NIST 08）进行定性分析，同时由Xcalibur软件系统完成手动对照检索，要求正反向匹配因子均大于850，可能性大于60%。利用面积归一法计算已鉴定挥发性物质相对含量，采用提取离子流方式报告代表性挥发性物质的峰面积。挥发性物质相对含量的计算按下式进行：

2 结果与分析

2.1 萃取头的选择

图1 3 种萃取头条件下金黄色葡萄球菌挥发性代谢物萃取数量（A）、相对含量（B）的比较Fig.1 Comparison of the composition of volatile metabolites fromS. aureusby using three fibers

由图1可知，采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头对金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物进行萃取，共鉴定出34 个化合物，其中醇类12 个、醛类8 个、酮类4 个、酸类4 个、酯类2 个、含硫和含氮化合物2 个、碳氢化合物0 个和其他2 个，分别占已检出挥发性成分总含量的43.08%、30.66%、10.86%、7.13%、3.69%、2.01%、0%和2.56%。在采用65 μm PDMS/DVB萃取头对金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物进行萃取，共鉴定出40 个化合物，其中醇类11 个、醛类8 个、酮类5 个、酸类7 个、酯类3 个、含硫和含氮化合物3 个、碳氢化合物1 个和其他2 个，分别占已检出挥发性成分总含量的41.85%、25.16%、4.34%、11.61%、6.16%、4.83%、0.60%和5.45%。采用75 μm CAR /PDMS萃取头对金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物进行萃取，共鉴定出30 个化合物，其中醇类9 个、醛类9 个、酮类3 个、酸类1 个、酯类2 个、含硫和含氮化合物2 个、碳氢化合物2 个和其他2 个，分别占已检出挥发性成分总含量的33.41%、30.84%、27.40%、0.76%、6.85%、0.34%、0.18%和0.22%。对于醇类和醛类化合物，3 种萃取头萃取的物质数量和相对含量都较高，对这2 类化合物有较好的萃取效果。对于酮类化合物，3 种萃取头萃取的物质数量相当，在相对含量上，75 μm CAR/PDMS萃取头＞50/30 μm DVB/CAR/ PDMS萃取头＞65 μm PDMS/DVB萃取头；对于酸类化合物，在数量和相对含量上，65 μm PDMS/DVB萃取头＞50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头＞75 μm CAR/PDMS萃取头。结果表明，50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头对于酮类和酸类化合物的萃取能力介于其他2 种萃取头之间。对于酯类、含硫、含氮化合物和碳氢化合物，3 种萃取头萃取的物质数量和相对含量都较低，且萃取效果差异较小。为满足各类化合物的萃取需要，以获得较全面的物质信息，选用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头进行萃取较为适宜。

2.2 萃取温度的选择

图2 3 种萃取温度条件下金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物数量比较Fig.2 Comparison of the numbers of volatile metabolites fromS. aureusat three extraction temperatures

表1 3 种萃取温度条件下金黄色葡萄球菌挥发性代谢物的峰面积比较Table 1 Comparison of volatile metabolites peak areas of S. aureus at three extraction temperatures

从图2可以看出，萃取温度为50 ℃时，共萃取出42 个物质，其中醇类13 个、醛类7 个、酮类7个、酸类2 个、酯类3 个、含硫和含氮化合物6 个、碳氢化合物2 个、其他2 个；萃取温度为65 ℃时，共萃取出44 个物质，其中醇类15 个、醛类9 个、酮类6 个、酸类2 个、酯类2 个、含硫和含氮化合物6 个、碳氢化合物2 个、其他2 个；萃取温度为80 ℃时，共萃取出47 个物质，其中醇类16 个、醛类9 个、酮类4 个、酸类7 个、酯类1 个、含硫和含氮化合物6 个、碳氢化合物1 个、其他3 个。在50、65 ℃和80 ℃ 3 种萃取温度条件下，金黄色葡萄球菌各类挥发性代谢物的数量差异较小，但从萃取物质总量来看，80 ℃萃取物质数量最高，这说明随着萃取温度的升高，萃取得到的物质数量增加。其次，从众多挥发性代谢物中筛选出20 种代表性化合物，采用提取离子流方式获得峰面积，从化合物响应强度上比较3 种萃取温度差异。由表1可知，随着萃取温度的升高，大多数挥发性代谢物峰面积都不断上升，3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、乙醇、乙酸、3-羟基-2-丁酮和丙酮的峰面积变化不明显，仅3-甲基-1-丁醇和2-甲基-1-丁醇的峰面积不断下降。因此，在萃取温度80 ℃条件下，萃取得到的金黄色葡萄球菌挥发性代谢物的数量和响应强度都较高。

2.3 萃取时间的选择

图3 3 种萃取时间条件下金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物数量比较Fig.3 Comparison in the numbers of volatile metabolites ofS. aureusby using three extraction times

从图3可以看出，萃取时间为20 min时，共萃取出46 个物质，其中醇类15 个、醛类9 个、酮类5个、酸类4 个、酯类2 个、含硫和含氮化合物7 个、碳氢化合物1 个、其他3 个；萃取时间为30 min时，共萃取出47 个物质，其中醇类15 个、醛类9 个、酮类4 个、酸类7 个、酯类2 个、含硫和含氮化合物6 个、碳氢化合物1个、其他3 个；萃取时间为40 min时，共萃取出45 个物质，其中醇类14 个、醛类9个、酮类4 个、酸类6 个、酯类2 个、含硫和含氮化合物6 个、碳氢化合物1 个、其他3 个。在20、30 min和40 min 3 种萃取时间条件下，金黄色葡萄球菌各类挥发性代谢物的数量差异较小，且挥发性代谢物的总数量相近。从表2可以得出，随着萃取时间的延长，2-甲基丁醛、3-甲基-1-丁醇、乙酸和吲哚的峰面积呈下降趋势，但下降程度不大。萃取时间在20～30 min之间，苯甲醛、苯乙醛、苯甲醇、1-辛醇、1-癸醇、3-甲基丁酸、正辛酸、正癸酸、十二烷酸、2-壬酮和2-十一酮的峰面积呈上升趋势，且上升程度明显；萃取时间在30～40 min之间，这些物质的峰面积变化较小。因此，综合考虑检测到的挥发性代谢物的数量和响应强度，选择萃取时间30 min较好。

表2 3 种萃取时间条件下金黄色葡萄球菌挥发性代谢物的峰面积比较Table 2 Comparison of volatile metabolites peak areas of S. aureus at three extraction times

2.4 最适萃取条件下金黄色葡萄球菌产生的主要挥发性物质

表3 最适萃取条件下金黄色葡萄球菌产生的挥发性物质Table 3 Volatile compounds produced byS. aureus under the optimal extraction conditions

从TSB空白培养基中检测出大量醛类物质如3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、苯甲醛和苯乙醛，发现它们的响应强度接近或大于在金黄色葡萄球菌TSB培养物中的响应强度，因此，确定检测出的醛类物质不是由金黄色葡萄球菌生长代谢活动所产生。从表3可以看出，在TSB空白培养基中没有检测出3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、乙酸、3-甲基丁酸、正辛酸、2-十一酮和3-羟基-2-丁酮，说明这些物质是由于金黄色葡萄球菌在TSB中生长代谢所产生；其他物质虽然在TSB空白培养基中被检测出，同样由于金黄色葡萄球菌的生长代谢活动，使得这些物质在金黄色葡萄球菌TSB培养物中的响应强度有所增加。在金黄色葡萄球菌产生的挥发性物质中，乙醇的响应强度最高，达到9×109；其次为1-癸醇、3-羟基-2-丁酮、丙酮、乙酸、苯甲醇、3-甲基-1-丁醇、吲哚、1-辛醇和正辛酸的响应强度为108，其余物质的响应强度为107。因此，在本实验建立的萃取条件下，金黄色葡萄球菌在TSB中产生的主要挥发性物质包括乙醇、1-癸醇、3-羟基-2-丁酮、丙酮、乙酸、苯甲醇、3-甲基-1-丁醇、吲哚、1-辛醇和正辛酸等。

3 讨 论

HS-SPME法萃取挥发性物质受到不同萃取头的差异、样品的萃取时间和萃取温度等因素的影响。同时在萃取头进样时，由于GC进样口热解吸的时间、温度和分流或不分流的进样模式等均会影响到分析的灵敏度、准确度和分析物的色谱保留时间、峰形[19]。本实验以萃取头类型、萃取时间和萃取温度进行单因素优化。采用纤维萃取头的固定相或吸附剂包括非极性的PDMS，弱极性的DVB和弱极性的CAR。65 μm PDMS/DVB萃取头是由聚二甲基硅氧烷和二乙烯苯复合材料涂布石英纤维而成，75 μm CAR/PDMS萃取头是由碳分子筛和聚二甲基硅氧烷复合材料涂布石英纤维而成，50/30 μm DVB/ CAR/PDMS萃取头则是由二乙烯苯、碳分子筛和聚二甲基硅氧烷复合材料涂布石英纤维而成。因此，可以看出，50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头的固定相材料包含了其他2 种萃取头的固定相材料，50/30 μm DVB/CAR/ PDMS萃取头对化合物极性的萃取要求具有更低的选择性，萃取适应性更为广泛。此外，75 μm CAR/PDMS萃取头适宜小分子质量化合物的萃取，而50/30 μm DVB/ CAR/PDMS萃取头和65 μm PDMS/DVB萃取头萃取的物质分子质量范围比较宽，能萃取到较大分子质量化合物。例如，正十四酸（相对分子质量228）和正十六酸（相对分子质量256）在选用65 μm PDMS/DVB萃取头得到的萃取物中被检出，而在选用75 μm CAR/PDMS萃取头得到的萃取物中未被检出。异雪松醇（相对分子质量222）和7,9-二叔丁基-1-氧杂螺（4,5）癸烯二酮（相对分子质量276）在选用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头得到的萃取物中被检出，而选用75 μm CAR/PDMS萃取头得到的萃取物中未被检出。Jia等[15]采用75 μm CAR/ PDMS萃取头萃取，检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和敏感型金黄色葡萄球菌MH肉汤培养物的挥发性代谢产物，发现敏感型金黄色葡萄球菌产生乙醇、1-丙醇、3-甲基-1-丁醇、乙醛、丙醛、乙酸、丙酸和3-甲基丁酸等。在实验中，用该萃取头对金黄色葡萄球菌TSB培养物的挥发性代谢产物进行萃取，也检出了许多小分子质量的醇、醛和酸等化合物，而对大分子物质的萃取效果较差，与Jia等[15]报道的结果吻合。

研究结果得出，金黄色葡萄球菌在TSB中产生的主要挥发性物质包括乙醇、1-癸醇、3-羟基-2-丁酮、丙酮、乙酸、苯甲醇、3-甲基-1-丁醇、吲哚、1-辛醇和正辛酸等。Filipiak等[14]在检测金黄色葡萄球菌TSB培养物时，没有检测出长链脂肪醇和甲基酮类，但检测出含量较高的物质有乙醇、3-甲基-1-丁醇、羟基丙酮、羟基丁酮、2,3-二丁酮、乙酸、异戊酸、乙醛、3-甲基-丁醛和2-甲基-丙醛。Elgaali等[20]在金黄色葡萄球菌TSB培养物中同样也未检出长链脂肪醇，酮类物质仅检测出C13烯酮。Bos等[21]综述前人研究报道，提出异戊酸和2-甲基-丁醛可以作为金黄色葡萄球菌的代表性物质。研究发现，醛类物质不是由金黄色葡萄球菌生长所产生的特异性物质，而是TSB培养基的挥发性物质；异戊酸是金黄色葡萄球菌产生的物质，但其响应强度较低。本研究结果与报道的结果有相似之处但也有差异，原因可能在于测试的菌株不同。另一方面，TSB培养基作为空白产生的挥发性物质在已报道的研究中没有被扣除。此外，萃取条件也存在差异。Elgaali等[20]采用的萃取条件是100 μm PDMS萃取头，在32 ℃条件下萃取15 min。Filipiak等[14]采用的萃取条件是75 μm CAR/PDMS萃取头，37 ℃条件下萃取10 min。通过单因素试验，阶段性选择最优条件后，得到适宜于金黄色葡萄球菌挥发性代谢物萃取的条件为采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头、萃取温度80 ℃、萃取时间30 min。本研究建立的HSSPME-GC-MS分析方法可以获得较全面的金黄色葡萄球菌挥发性代谢产物组成信息。

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Optimization of Headspace Solid Phase Micro-Extraction Conditions for GC-MS Analysis of Volatile Metabolites from Staphylococcus aureus

SHI Hui, TANG Junni, CHEN Juan*, WANG Qiong
(College of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China)

Volatile metabolites from Staphylococcus aureus cultured with tryptone soy broth (TSB) were extracted under different conditions namely three types of fi ber (65 μm PDMS/DVB fi ber, 75 μm CAR/PDMS fi ber and 50/30 μm DVB/ CAR/PDMS fiber), three extraction times (20, 30 and 40 min) and three extraction temperatures (50, 65 and 80 ℃), respectively. The extracts were detected by gas chromatography-mass spectroscopy (GC-MS). The optimal extraction conditions were determined. The results indicated that 50/30 μm DVB/CAR/PDMS fi ber was suitable for the extraction of various components and more comprehensive information was obtained using this fi ber. Abundant amounts and response intensities of bacterial volatile metabolites were extracted at 80 ℃ for 30 min. Accordingly the optimal extraction conditions for volatile metabolites from S. aureus were obtained. Using the established extraction method, the main volatile compounds produced by S. aureus cultured in TSB were detected to be alcohol, 1-decanol, 3-hydroxy-2-butanone, acetone, acetic acid, benzyl alcohol, 3-methyl-1-butanol, indole, 1-octanol and octanoic acid. This extraction method can provide a valuable tool for the analysis of bacterial volatile metabolites.

Staphylococcus aureus; volatile metabolites; extraction condition; optimization; headspace solid phase micro-extraction gas chromatography-mass spectroscopy (HS-SPME-GC-MS)

TS201.6

A

1002-6630（2015）12-0185-06

10.7506/spkx1002-6630-201512034

2014-10-28

国家自然科学基金面上项目（31371781）；教育部“新世纪优秀人才支持计划”项目（NCET-11-0847）；

西南民族大学研究生创新项目（CX2014SP263）

史辉（1990—），男，硕士研究生，研究方向为食品质量与安全。E-mail：823371756@qq.com

*通信作者：陈娟（1980—），女，副研究员，博士，研究方向为食品微生物与食品安全。E-mail：chenj1221@126.com