3 种酵母发酵生产红树莓酒香气成分的GC-MS分析

刘亚娜，杨 华，郭德军,*

（黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319）

3 种酵母发酵生产红树莓酒香气成分的GC-MS分析

刘亚娜1，杨 华2，郭德军1,*

（黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319）

以D254、71B、D153种果酒酵母进行发酵制备红树莓酒，并分析其香气化学成分。采用顶空-固相微萃取法提取3种酵母酿造的红树莓酒香气成分；利用气相色谱-质谱进行香气成分的分离测定，结合计算机检索技术对分离化合物进行鉴定，利用峰面积归一法测定各香气化学成分的相对含量，共鉴定出105种香气成分，其中D254、71B、D15酵母发酵的红树莓酒中分别检测出35、48、57种香气成分，共有8种成分相同。D254酵母发酵的红树莓酒的主要香气成分为3-甲基-1-丁醇（54.39%）；71B酵母发酵的红树莓酒的主要香气成分为丙烯酸异辛酯（12.41%）、脱羰秋水仙碱（12.06%）、癸酸乙酯（8.21%）；D15酵母发酵的红树莓酒的主要香气成分为三辛酸甘油酯（11.06%）和安非拉酮（8.81%）。综合气相色谱-质谱分析与感官评价结果表明，71B酵母发酵生产的红树莓酒香气较好，适宜大众口味，从而得出71B酵母为生产红树莓酒的最优菌株。

红树莓酒；不同酵母；香气成分；气相色谱-质谱法

红树莓属于蔷薇科悬钩子属多年生落叶灌木，俗称是“覆盆子”、“托盘”等[1]。红树莓富含丰富的营养物质，如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、花青素、VE、氨基酸、鞣花酸等[2]，同时还含有黄酮、类黄酮[3-4]、白藜芦醇等多种抗氧化物质，其中VE、SOD等成分的含量高于其他浆果，且具有美容、抗衰老、增强免疫力、抗癌、抗心血管疾病等功效[5]。以红树莓为原料酿制的红树莓酒，具有低酒精体积分数、高营养、益脑健身、促进血液循环、加快机体的新陈代谢、平衡体内胆固醇水平、改善心脑血管功能，同时具有利尿、激发肝功能等保健功效[6]。随着人们对身体健康的重视程度逐渐加深，红树莓酒具有广泛的应用前景。

本实验选取3种不同酵母对相同的红树莓果汁采取相同工艺进行发酵，采用顶空-固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）法提取酒样中的香气化学成分[7]，并利用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法对不同酵母发酵生产的红树莓酒香气化学成分进行鉴定[8]，通过对比分析研究不同酵母发酵酿造红树莓酒的主要香气化学成分组成及相对含量的差异，选取出优良的酿酒酵母[9]，从而为红树莓酒香气化学成分的分析研究和感官风味评价体系的建立提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

红树莓（主要成分含量：水分5 6%、总糖5.6 g/100 g、pH 3.22、蛋白质0.2 g/100 g、灰分0.5 g/100 g、花青素42.1 mg/100 g） 大兴安岭超越公司；果酒干酵母D254烟台帝伯仕自酿机有限公司；果酒干酵母71B法国拉氟德公司；果酒酵母D15黑龙江八一农垦大学食品学院微生物实验室；果胶酶（2 000 U/g） 生工生物工程股份有限公司。

1.2仪器与设备

7890A/5975GC-MS联用仪 美国Agilent公司；固相微萃取装置、聚二甲基硅氧烷/二乙基苯100 ☒m萃取头美国Supelco公司。

1.3方法

1.3.1红树莓酒的制备

图1 红树莓酒制备工艺流程图Fig.1 Flow diagram for the production of red raspberry wine

图1为红树莓酒制备的工艺流程图，制备过程中操作要点如下：

1）制备红树莓酒：红树莓过滤取果汁，添加质量分数0.4%果胶酶，50 ℃恒温水浴2 h，添加蔗糖200 g/L，添加CaCO3调整pH值使红树莓果汁pH值为4.0。

2）酵母的活化：干酵母处于休眠期，活化可以使干酵母脱离休眠期从而恢复酵母细胞的正常功能，增强酵母活性。D254和71B干酵母活化处理：分别取D254干酵母和71B干酵母1 g，35～40 ℃条件下置于20 mL质量分数2%蔗糖溶液中并搅拌15 min，30 ℃恒温静置1.5 h后即可使用[10]。D15酵母活化处理：取—80 ℃冷冻D15酵母于常温解冻，接种在酵母浸出粉胨葡萄糖培养基后28℃恒温摇床摇菌1 d即可使用[11]。

3）接种：将活化后的3种酵母菌制得的酵母分别按质量分数7%接种量接种于200 mL澄清红树莓果汁中，26℃恒温发酵8 d。

1.3.2红树莓酒香气成分分析

取30 mL红树莓酒样品置于50 mL顶空瓶中，加入0.1 g/mL NaCl溶液，并以聚四氟乙烯隔垫密封，置于70℃条件下萃取40 min后，将萃取针插入GC进样口，解吸1.5 min[12]，同时启动仪器，分析样品并采集数据。

1.3.3 GC-MS分析条件

利用GC-MS测定其香气化学成分的种类及各成分相对含量，对比分析3种酵母发酵生产的红树莓酒香气化学成分共同点及差别，确定酿造红树莓酒的最优酵母菌株。

1.3.3.1 GC条件[13]

DB-5MS色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25μm）；升温程序：初始温度80℃保持5 min，以5℃/min升至270℃，保持1 min；传输线温度230℃；载气为高纯He（99.999%）；载气流速1.0 mL/min。

1.3.3.2 MS条件

进样口温度250℃；电子电离源；电子能量70 eV；离子源温度250℃；四极杆温度150℃；质量扫描范围50～550 u；对采集到的质谱图利用NIST 08.L谱库进行检索，并用峰面积归一化定量计算出各香气成分在3种红树莓酒样中的相对含量。

1.3.4红树莓酒感官评定

红树莓酒的评分标准参照中国葡萄酒品评标准，得分由项目组10名成员品评后打分，取平均值[14-15]，评分标准见表1。感官要求：色泽：深红色，有光泽，澄清透明；香气：果香、酒香浓馥优雅、悦人；口味：醇厚协调、舒服、爽口、回味延绵；风格：风格独特，幽雅无缺[16]。

表1 红树莓酒感官评分标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of red raspberry wines

1.3.5 红树莓酒理化指标测定

酒精体积分数、总糖含量和总酸含量的测定：分别采用GB/T 15038—1994《葡萄酒、果酒通用试验方法》蒸馏比重法、斐林试剂滴定法和电位滴定法。

2 结果与分析

2.1不同酵母发酵的红树莓酒中香气成分GC-MS分析

表2 3 种不同酵母发酵的红树莓酒及红树莓果汁主要香气成分Table 2 Main aroma components of red raspberry wines fermented with three different yeast strains and raspberry juice

续表2

续表2

如表2所示，采用HS-SPME和GC-MS技术在3种酒样中共鉴定出105种香气成分，主要是醇类14种、酯类37种、酸类5种、烷烯烃类19种、醛酮类9种、苯酚类5种、其他类16种；而在红树莓果汁中共鉴定出32种香气成分，主要为醇类4种、酯类8种、酸类1种、烷烯烃类6种、醛酮类2种、苯酚类4种、其他类7种。

图2 2DD225544（A）、71B（BB）、DD1155（C）酵母发酵生产的红树莓酒香气成分的GC-MS总离子流色谱图Fig.2 Total ion current chromatograms of red raspberry wine fermented with D254(A), 71B(B), and D15(C) yeast strains and raspberry juice by GC-MS

由图2和表2可知，在D254酵母酿造的树莓果酒中，共检测出35种香气成分，占总峰面积的97.94%。其中，醇类58.79%、酯类21.74%、酸类0.86%、烷烯烃类12.67%、醛酮类1.09%、苯酚类0.79%、其他类2.00%。其主要香气成分为3-甲基-1-丁醇（54.39%）、正己酸乙酯（5.31%）、环三聚二甲基硅氧烷（4.74%）、苯乙醇（2.86%）、丁酸-1-乙烯基-1,5-二甲基-4-己烯基酯（2.78%）。在71B酵母酿造的树莓酒中，共检测出48种香气成分，占总峰面积的83.03%。其中，醇类4.83%、酯类50.16%、酸类0.39%、烷烯烃类7.62%、醛酮类1.24%、苯酚类5.01%、其他类14.42%。其主要香气成分为丙烯酸异辛酯（12.41%）、脱羰秋水仙碱（12.06%）、癸酸乙酯（8.21%）、9-十六碳烯酸乙酯（7.21%）、辛酸乙酯（5.23%）、六甲基环三硅氧烷（3.13%）、1,3-二（三甲基甲硅烷基）苯（2.90%）、正己酸乙酯（2.84%）。在D15酵母酿造的树莓酒中，共检测出57种香气成分，占总峰面积的86.11%。其中，醇类9.41%、酯类29.89%、酸类7.42%、烷烯烃类17.27%、醛酮类9.08%、苯酚类4.37%、其他类8.67%。其主要香气成分为三辛酸甘油酯（11.06%）、安非拉酮（8.81%）、3-甲基-1-丁醇（7.15%）、八甲基三硅氧烷（6.80%）、2-（三氟甲基）苯甲酸（6.05%）、六甲基环三硅氧烷（4.52%）、正二十烷（3.67%）、4-十八基吗啉（3.32%）、3,5-二叔丁基-1,2-苯二酚（3.03%）、十二酸乙酯（2.90%）、癸酸乙酯（2.60%）、酯二十四烷酸乙酯（2.57%）。

2.2不同酵母发酵的红树莓酒的主要香气成分比较分析

国内外较多报道葡萄酒的酿造工艺与香气成分分析[17-20]，对红树莓酒酿造工艺报道较多，而对香气成分测定分析较少，因此本实验采用HS-SPME法提取对红树莓酒中的香气成分进行分析。酒的香气成分中醇类和酯类占的相对含量较高，其中醇类物质在呈香上起主要作用[21]，同时又是形成酯类物质的前体，3种酵母发酵生产的果酒及红树莓果汁中醇类物质相对含量分别为58.79%、4.83%、9.41%、5.11%。含量差距较大，其中71B酵母发酵生产的红树莓酒中醇类物质相对含量较红树莓果汁低0.28%，说明此种酵母对醇类物质有降低的作用，而D254酵母与D15酵母发酵生产的红树莓酒中醇类物质相对含量分别较红树莓果汁高出53.68%与4.30%，其中相对含量最高的物质都是3-甲基-1-丁醇分别为54.39%与7.15%；但71B酵母发酵生产的红树莓酒中并不含3-甲基-1-丁醇，说明并非所有酵母发酵生产的红树莓酒中都会产生3-甲基-1-丁醇。3-甲基-1-丁醇具有青草、植物香气，这种香气具有持久保持的作用，因此在食品工业中用于调香[22]。D254酵母发酵产生醇类物质含量较高，因此适宜于快速发酵生产酒精体积分数稍高的红树莓酒。通常醇类物质具有刺鼻的气味，对于果酒的酒香有负效应影响，但D254酵母与71B酵母发酵的果酒中共有的醇类物质苯乙醇不同于其他醇类物质，不仅具有杀菌作用，而且还会产生玫瑰和茉莉花香，给人柔和愉悦的感觉[23]。

红树莓果实以酯类为香气的主要来源，而通过3种酵母发酵生产的红树莓酒中，其相同的香气成分并不多，且含量区别较大，说明红树莓果汁发酵后其香气成分有较大的改变。本研究中，在3种红树莓酒中共检测出酯类物质37种，其中共有酯类物质6种。71B酵母中酯类物质的相对含量更高达50.16%，较红树莓果汁高1.36%，且其主要的酯类物质分别为丙烯酸异辛酯、癸酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、辛酸乙酯；而D254酵母与D15酵母发酵生产的红树莓酒中酯类物质相对含量分别为21.74%、29.89%，较红树莓果汁分别低27.06%、18.91%，而其主要的酯类物质分别为正己酸乙酯、三辛酸甘油酯。大多数酯类具有花、果香气，如：辛酸乙酯略带有玫瑰、橙子的花果香气，此香味为白兰地酒特有的香气；癸酸乙酯具有葡萄的水果香气[13]；正己酸乙酯具有似苹果、香蕉味、梨的酸甜味的水果香气。由此，发酵过程所选择的发酵酵母菌株不同对其发酵所产生的酯类化合物的种类与相对含量有很大的影响，且酯的种类与相对含量的不同会决定酒的香味和风格。

以D254酵母和71B酵母发酵产生的红树莓酒中的酮类物质较少，其含量均低于红树莓果汁；而酿酒酵母D15发酵生产的红树莓酒中的酮类物质相对含量较红树莓果汁高6.12%，其中酮类物质主要为安非拉酮，其相对含量高达8.81%。安非拉酮是非苯丙胺类，有抑制食欲的作用，可使人产生饱腹感，从而起到控制食欲、降低食量的作用[24]，并且安非拉酮对心血管系统的影响较小，因此可用于具有轻度心血管疾病的肥胖病人的辅助治疗[25]。

3种不同酵母发酵生产的红树莓酒中共检测出酸类物质5种，且其中没有共有酸类物质，在D15酵母发酵的红树莓酒中产生酸性物质相对含量较高的是2-（三氟甲氧基）苯甲酸，其相对含量为6.05%；其他2种酵母发酵生产的红树莓酒中酸类物质相对含量都很少。2-（三氟甲氧基）苯甲酸对呼吸系统具有刺激性，并且使酒具有酸涩感，且酸类化合物的呈香性相对比较小，对红树莓酒的香味影响较小。

3种红树莓酒中醇类和酯类所占的相对含量较高，因此其在果酒的香气中起到主要的作用，而烷烃类、醛酮类、酚类、苯环类和其他16种成分所占的相对含量较少，对红树莓酒香气影响较小。

2.3感官评定与理化指标测定分析

表 3 红树莓酒理化指标测定Table 3 Physical and chemical parameters of red raspberry wines fermented with D254,71B and D15 yeast strains

对红树莓酒进行感官评定和理化指标测定，结果见表3。71B酵母产酒能力强，残糖少，酸度较低，感官评定总分较高，且风格与口味较佳；D254酵母产酒能力强，酸度较低，但感官评定总分低，风味、口感皆不佳；D15酵母产酒香气较佳，但酒口感酸涩，缺乏红树莓酒应有的风格与口味。

3 结 论

采用HS-SPME提取待研究不同酵母发酵生产的红树莓酒样中的香气化学成分，并通过GC-MS进行分析检测。3种酒样中共检测出香气化学成分105种，其中8种为共有香气成分，在D254、71B酵母和D15酵母发酵的红树莓酒中检出香气成分分别为35、48、57种，并用峰面积归一化法来定量分别计算出各香气成分在3种酒样中的相对含量，经检测可知3种酒之间的香气组分及相对含量差别均较大。D254酵母发酵的红树莓酒的主要香气成分为3-甲基-1-丁醇，相对含量为54.39%；71B酵母发酵的红树莓酒的主要香气成分为丙烯酸异辛酯，相对含量为12.41%；D15酵母发酵的红树莓酒的主要香气成分为三辛酸甘油酯，相对含量为11.06%。研究结果表明，以不同酵母发酵的红树莓酒香气成分差异显著，因此酵母菌种选取对红树莓酒香气成分组成及相对含量具有重要的影响。由于红树莓酒中香气成分种类繁杂，因此各成分之间协同，抑制作用强烈，从而使其香气成分出现增加或减少的现象，会影响红树莓酒的感官风味。此外，鉴定红树莓酒除评价其特征香气，还结合人体嗅觉感官分析，实验表明以71B酵母为发酵菌种的红树莓酒香气清新，有玫瑰花香，且色泽澄清，呈樱桃红色，口感柔和，无酸涩感，无过重的酒味。综合GC-MS分析及感官评定结果，选取71B酵母为酿造红树莓酒的最优菌种。

参考文献：

[1]房玉林,赵现华,张昂.不同酿造工艺对树莓干酒香气成分的影响[J].西北农林科技大学学报:自然科学版, 2008, 36(11): 197-202.

[2]王文芝.树莓果实营养成分初报[J].西北园艺, 2001(2): 13-14.

[3]刘建华,张志军,李淑芳.树莓中功效成分的开发浅论[J].食品科学, 2004, 25(10): 370-373.

[4]郭军战,彭少兵,陈铁山.树莓和黑莓引种品种果实营养成分分析[J].西北林学院学报, 2004, 19(1): 108-109.

[5]姜河,修英涛,蔡骞.我国树莓发展现状及产业化前景分析[J].辽宁农业科学, 2006(2): 45-48.

[6]罗智勇.红树莓干红加工工艺研究[D].长春:吉林农业大学, 2008: 1-45.

[7]张影陆,范文来,姜文广.顶空固相萃取法测定果酒中的挥发性成分[J].食品与生物技术学报, 2008, 27(6): 115-120.

[8]成晓玲,庄玉婷,李艳.气相色谱及气质联用在葡萄酒香气成分分析检测中的应用进展[J].酿酒科技, 2010(11): 83-86.

[9]王家利,辛秀兰,陈亮.气相色谱-质谱法分析比较不同酵母发酵红树莓果酒的香气成分[J].食品科学, 2014, 35(6): 107-112. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201406022.

[10]焦瑞身.微生物工程[M].北京:化学工业出版社, 2003: 22-27; 105-120.

[11]何晶龙,彭超,郭德军.笃斯越桔酒发酵工艺的研究[J].中国酿造, 2010, 28(8): 166-169.

[12]李锐,冯奎,吴婧.不同来源酿酒酵母对柑橘果酒香气成分的影响[J].食品科学, 2010, 31(17): 206-213.

[13]盖禹含,辛秀兰,杨国伟.不同酵母发酵的蓝莓酒香气成分GC-MS分析[J].食品科学, 2010, 31(4): 171-174.

[14]刘彬.葡萄酒的感官分析[J].酿酒科技, 2005(8): 89-91.

[15]郭其昌,郭松泉,张春娅.葡萄酒品尝[M].北京:中国轻工业出版社, 2002.

[16]魏永春,苟斌全,张志良.苹果酒发酵工艺研究[J].广东化工, 2011, 38(1): 32-34.

[17] GARRUTIA D S, FRANCOB M R B, da SILVAB M A A P, et al. Assessment of aroma impact compounds in a cashew apple-based alcoholic beverage by GC-MS and GC-olfactometry[J]. Food Science and Technology, 2006, 39(4): 373-378.

[18] SELLI S, CANBAS A, CABAROGIU T. Effect of skin contact on the free and bound aroma compounds of the white wine ofVitis viniferaL. cv. Narince[J]. Food Control, 2006, 17(1): 75-82.

[19] SCHNEIDER R. Volatile compounds involed in the aroma of sweet fortified wines from Grenache noir[J]. Journal of Food Science, 1998, 46(8): 3230-3237.

[20]李华,胡搏然,杨新元.蛇龙珠干红葡萄酒香气成分的GC-MS分析[J].分析测试报, 2004, 23(1): 85-87.

[21]汪建国.黄酒的贮存与色香味关系[J].中国酿造, 2007, 25(10): 48-52.

[22]李景明,于静,吴继红.不同酵母发酵的赤霞珠干红葡萄酒香气成分研究[J].食品科学, 2009, 30(2): 185-189.

[23]郭惜雅,张丽玲,黄鹭强.固相微萃取-气质联用分析杨桃酒的主要香气成分[J].农产品加工:学刊, 2011(5): 92-94.

[24]吴平,胡永狮,杜青云.减肥药物的分类及其作用机制[J].中国临床药学杂志, 2000, 9(2): 131-134.

[25]刘雅南,冯文焕.肥胖症的药物治疗进展[J].现代生物医学进展, 2011, 11(20): 3997-4000.

GC-MS Analysis of Arom Chemical Composition of Red Raspberry Wines Fermented with Three Different Yeast Strains

LIU Yana1, YANG Hua2, GUO Dejun1,*

(College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China)

The aroma components of red raspberry wines fermented with three different wine yeast strains, D254, 71B and D15, were extracted with headspace-solid phase micro extraction (HS-SPME) and then separated and identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) through mass spectral library search. Total ion current (TIC) peak area normalization method was used to determine the relative contents of aroma components. A total of 105 flavor components were detected, among which 35, 48 and 57 compounds were detected in red raspberry wines fermented with D254, 71B and D15, respectively, with 8 being common to these three samples. The main aromatic compound in red raspberry wine fermented with D254was 1-buten-ol-3-methyl (54.39%) while those in the wine fermented with 71B were 2-propenoic acid octyl ester (12.41%), demecolcine (12.06%) and ethyl caprate (8.21%), and were glycerol tricaprylate (11.06%) and amfepramone (8.81%) in the wine fermented with D15. Overall, GC-MS analysis and sensory evaluation suggested that red raspberry wine fermented by 71B contains more aroma substances and is suitable for the pubic taste. Thus, 71B could be the best yeast strain for the production of red raspberry wine.

red raspberry wine; yeast strain; aroma components; gas chromatography-mass spectrometry

TS207.3；TS261.1

A

1002-6630（2015）12-0160-06

10.7506/spkx1002-6630-201512030

2014-11-07

农垦总局技术开发课题（HNK13KF-15-01）

刘亚娜（1989—），女，硕士研究生，研究方向为食品微生物。E-mail：985974520@qq.com

*通信作者：郭德军（1968—），男，教授，博士，研究方向为食品微生物。E-mail：187013609@qq.com