响应面法优化超临界CO2萃取鲍鱼内脏油脂及其脂肪酸种类测定

汤 鹏，段海霞，夏金梅*，翁武银，李 倩，许建中，林 翌，许 晨

（1.集美大学食品与生物工程学院，福建 厦门 361021；2.宁波大学海洋学院，浙江 宁波 315211；3.国家海洋局第三海洋研究所，海洋生物遗传资源重点实验室，福建 厦门 361005）

响应面法优化超临界CO2萃取鲍鱼内脏油脂及其脂肪酸种类测定

汤 鹏1，段海霞2，夏金梅3,*，翁武银1，李 倩3，许建中3，林 翌3，许 晨3

（1.集美大学食品与生物工程学院，福建 厦门 361021；2.宁波大学海洋学院，浙江 宁波 315211；3.国家海洋局第三海洋研究所，海洋生物遗传资源重点实验室，福建 厦门 361005）

以鲍鱼内脏为原料，采用超临界CO2流体萃取油脂。根据萃取温度、萃取压力、静态萃取时间对油脂萃取率影响的结果，运用SAS 9.2统计学软件进行响应面试验设计，优化萃取条件。结果表明，超临界CO2萃取鲍鱼内脏油脂的最佳条件为：萃取压力31.2 MPa、萃取温度42.3 ℃、静态萃取时间9.4 min。在该条件下的实际萃取率为75.23%。将获得的油脂，利用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱检测，结果发现，萃取鲍鱼内脏油脂中共有39 种不同碳链长度和双键数目的脂肪酸，其中饱和脂肪酸9 种、单不饱和脂肪酸8 种、多不饱和脂肪酸22 种。

超临界CO2；响应面；鲍鱼内脏；质谱

鲍鱼是一种海洋单壳软体贝类，属软体动物门、腹足纲、原始腹足目、鲍科[1]。研究表明，鲍鱼内脏中含有大量的蛋白质、脂质和碳水化合物，其中占鲍鱼内脏湿基质量4%左右的脂质[2]，含有丰富的不饱和脂肪酸和磷脂[3-5]，有较高的食用和药用价值[6-7]。目前，我国鲍鱼加工中，绝大部分鲍鱼内脏仅作为饲料使用，附加值低。我国鲍鱼养殖规模世界第一，并且增长迅速。2010年，我国鲍鱼总产量占世界总产量的86%，达到5.65万 t[8]，2012年已突破9万 t，鲍鱼内脏油脂提取将形成一宗很好的自然油脂资源。

从水产品及其副产物中提取油脂的传统方法包括有机溶剂浸提法[9]、压榨法[10]、蒸煮法[11]、稀碱法[12-13]和酶解法[14]等。这些方法有的涉及有机溶剂，有的涉及高温或较长的提取时间，会造成溶剂残留或不饱和脂肪酸氧化，从而降低油脂的品质。随着人们对食品安全问题的日益关注以及对天然油脂的需求增加，传统提取技术的不足促使人们寻求新的替代技术。超临界CO2萃取技术不仅能提供温和、无氧的操作条件，降低萃取过程中不饱和脂肪酸的氧化，而且还能选择性地萃取极性较低的脂质物质，萃取物纯度较高。CO2无味、无臭、无毒、不燃，萃取后通过压力释放可以非常方便地实现溶剂与脂质的分离，免除溶剂的蒸馏分离问题，后处理简单。在过去几年里，采用超临界CO2流体从水产品加工副产物中提取高品质油脂引起了许多研究者的兴趣[15-18]。但采用超临界CO2流体萃取鲍鱼内脏油脂，国内外罕见报道。本实验研究超临界CO2流体提取鲍鱼内脏油脂的工艺条件，分析检测萃取油脂的组分，为鲍鱼油脂的分析检测、提取利用建立技术依据。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

鲍鱼内脏岛之原生物科技有限公司；CO2气体（纯度＞99.5%）林德气体有限公司。

1.2仪器与设备

超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱仪美国Waters公司；Spe-ed SFE-2型超临界CO2萃取仪美国Applied Separations公司；UV-9100紫外分光光度计北京瑞利分析仪器公司；XFB-800中药粉碎机吉首市中州制药机械厂；离心浓缩仪北京勤诚盛达科学仪器有限公司；JA4103型精密电子天平苏州江东精密仪器有限公司；DHG-9023A型电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司；DZF-6050型真空干燥箱上海一恒科技有限公司；B-811型通用萃取系统瑞士Büchi公司；QP-2010 Plus气相色谱-质谱联用仪日本岛津公司。

1.3方法

1.3.1鲍鱼内脏粉水分含量的测定

按照GB 5009.3—2010《食品中水分的测定》规定的方法，精确称取5.000 0 g鲍鱼内脏粉于烘干至恒质量的称量瓶中，置105℃中干燥4 h后，取出放入干燥器内冷却0.5 h，称质量后再放入105℃烘箱中烘干2 h，取出，放入干燥器内冷却0.5 h后再称质量。重复上述操作至前后2次质量差不超过2 mg，即为恒质量。按公式（1）计算水分含量。

式中：X0为鲍鱼内脏粉水分含量/%；m0为称量瓶和鲍鱼内脏粉烘干后质量/g；m1为称量瓶和鲍鱼内脏粉质量/g；m2为称量瓶质量/g。

1.3.2鲍鱼内脏粉总脂肪提取

精确称取鲍鱼内脏粉5.00 g，置于索式提取器提取室中，石油醚回流提取6 h，收集萃取相，挥干石油醚后用离心浓缩仪除去水分，称质量。按公式（2）计算总脂肪含量。

式中：X1为鲍鱼内脏粉总脂肪含量/%；m3为接收瓶质量/g；m4为接收瓶和萃取脂肪质量/g；m5为鲍鱼内脏粉质量/g。

1.3.3超临界CO2萃取鲍鱼内脏油脂

取10.00 g鲍鱼内脏粉放入50 mL萃取釜中，调节萃取压力、萃取温度到设定值，静态萃取一定时间后，打开降压阀，油脂沉降在收集管中，排出CO2。减压过程中CO2的流速为1.5 L/min，分离温度70℃。将收集到的油脂用离心浓缩仪除去水分后称质量。按公式（3）计算萃取率。

式中：X2为超临界CO2萃取鲍鱼内脏油脂萃取率/%；m6为接收管质量/g；m7为接收管和萃取脂肪质量/g；m8为鲍鱼内脏粉质量/g。

1.3.4 超临界CO2萃取条件的优化

采用单因素试验考察原料含水量、萃取压力、萃取温度、静态萃取时间对萃取率的影响，单因素试验的因素与水平见表1。在单因素试验基础上，用SAS 9.2统计学软件，根据Box-Behnken试验设计原理，选择萃取压力（X1）、萃取温度（X2）和静态萃取时间（X3）主要影响因素为自变量，以萃取率为响应值，采用响应面分析法，对鲍鱼内脏油脂超临界CO2萃取条件参数进行优化。Box-Behnken试验设计因素与水平见表2。

表1 单因素试验因素水平表Table 1 Factors and levels used in one-factor-a-time design

表2 Box-Behnken试验设计因素与水平编码表Table 2 Factors and their coded levels used inBox-Behnken experimental design

1.3.5鲍鱼内脏油脂的皂化和甲酯化

取上述萃取得到的油脂样品，加入1 mol/L氢氧化钾-乙醇溶液，70℃回流加热2 h。反应结束后，加入正己烷萃取不皂化物，弃去正己烷层。收集下层溶液并向其中依次加入2 mol/L盐酸溶液、大量水和一定量正己烷，分离得到正己烷层并旋干，即得到脂肪酸。脂肪酸中加入一定量1%硫酸-甲醇溶液，60℃回流5 h后，加入大量水和一定正己烷，将分离得到的正己烷层用水洗至中性，加入无水硫酸钠，分离正己烷溶液并旋干，即得到脂肪酸甲酯[19]。准确称取所得脂肪酸样品0.020 00 g，用乙腈溶液定容至20 mL，即得用于液相色谱-质谱分析的1 mg/mL样品乙腈溶液。准确称取所得脂肪酸甲酯样品0.020 00 g，用正己烷溶液定容至20 mL，即得用于气相色谱-质谱分析的1 mg/mL样品正己烷溶液。

1.3.6 脂肪酸的分析

1.3.6.1 液相色谱及质谱条件

色谱条件：XBrideg BEH C18色谱柱（2.1 mm× 100 mm，2.5 μm）；流动相：A为超纯水，B为色谱级乙腈；流动相梯度：0～10 min，流动相B为75%，10～25 min，流动相B由75%升到100%；流速0.3 mL/min；进样量1 μL。

一级质谱条件：电喷雾离子源，负离子模式；数据采集范围m/z 50～1 200；毛细管电3 kV；锥孔电压40 V；离子源温度100℃；脱溶剂气温度350℃；脱溶剂气流速600 L/min；锁定质荷比物质：亮氨酸脑啡肽，其在负离子模式下的精确质荷比为554.261 5。

1.3.6.2 气相色谱及质谱条件

色谱条件：R x i®-5 M S弹性石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：初始温度170 ℃，以2 ℃/min升至250 ℃，再以250 ℃保持20 min；进样量1 μL；载气（He）流量1 mL/min；吹扫气流量3 mL/min；分流比为1∶10。

质谱条件：电子电离源；离子源温度250℃；电子倍增器电压1 000 V；接口温度250℃；质量扫描范围m/z 40～500；溶剂切除时间3.52 min。

1.4数据处理

液相色谱使用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱系统采集得到谱图数据，通过MassLynx 4.1软件进行分析。

气相色谱-质谱通过Postrun Analysis化学工作站数据处理系统，检索NIST 27和NIST 147谱图库，确定样品中各个化学成分。

2 结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1原料含水量对萃取率的影响

图1 原料含水量对萃取率的影响Fig.1 Effect of raw material moisture content on extraction rates

在萃取压力30 MPa、萃取温度45℃、静态萃取时间15 min条件下，考察原料含水量对萃取率的影响。通过1.3.1节方法测得在自然条件下晾干的鲍鱼内脏粉含水量为10.48%，通过回吸法和真空干燥法得到其他不同含水量的样品。原料含水量对萃取率的影响如图1所示，随着含水量的增大，萃取率先增大后减少，当含水量为10.48%时萃取率达到最大。含水量对萃取率的影响体现在两个方面：适当的含水量有利于超临界CO2的扩散、传质和油脂在超临界CO2中的溶解；水分含量低时，这种促进作用较小，油脂的提取率降低；水分含量高时，传质阻力增大，不利于CO2的渗入和油脂的溶出。所以样品选择自然晾干处理。

2.1.2萃取压力对萃取率的影响

图2 萃取压力对萃取率的影响Fig.2 Effect of extraction pressure on extraction rates

选取含水量为10.48%的样品，在萃取温度45 ℃条件下静态萃取15 min，考察萃取压力对萃取率的影响，结果见图2。由于设备所能承受的最大压力为35 MPa，所以试验时的最大压力设置为33.5 MPa。从图2可以看出，萃取率随萃取压力的增加而增大，当压力超过25 MPa后，萃取率增大速率相对变缓。这是由于当萃取温度一定时，随着萃取压力的升高，超临界CO2的密度增大，其对溶质的溶解能力增加[20]。但萃取压力持续增大，超临界CO2的不可压缩性将逐渐增强，其密度变化率将减小，溶解度的增幅将降低。此外，高压会增加设备的投入和操作费用，且存在安全隐患。所以从经济和安全的角度考虑，萃取压力选择30 MPa。

2.1.3萃取温度对萃取率的影响

图3 萃取温度对萃取率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rates

选取含水量为10.48%的样品，在萃取压力30 MPa条件下静态萃取15 min，考察萃取温度对萃取率的影响，结果见图3。萃取率随着萃取温度的升高呈先增后减的趋势，40 ℃时萃取率达到最大。萃取压力一定时，萃取温度对溶质在超临界CO2流体中的溶解度有两个方面的影响：当萃取温度升高时，溶质的蒸汽压增大，提高了传质动力，有利于萃取率的提高；另一方面，随着萃取温度的升高，超临界CO2流体的密度降低、溶剂化效应下降，使溶质的溶解度下降，萃取率降低[21]。因此，萃取温度对萃取率的影响取决于上述两个方面的竞争关系。试验选择40 ℃为最适温度。

2.1.4静态萃取时间对萃取率的影响

图4 静态萃取时间对萃取率的影响Fig.4 Effect of static extraction time on extraction rates

选取含水量为10.48%的样品，在萃取压力30 MPa、萃取温度40 ℃条件下，考察静态萃取时间对萃取率的影响，结果见图4。萃取率随着静态萃取时间的延长呈现先增加后减小的趋势，在静态萃取时间为10 min时萃取率达到最大。萃取初期，由于溶质和溶剂未达到良好接触，萃取率较低；随着静态萃取时间的延长，体系逐渐达到最佳的传质状态，萃取率逐渐增加至最大值；随后，由于萃取对象中待分离成分含量减少而使单位时间萃取量逐渐下降，静态萃取时间对萃取率提高的影响逐渐减弱。静态萃取时间大于10 min后，萃取率会略有下降，可能是由于已萃取出的油脂被CO2气体从解吸缸中带出所致。

2.2 Box-Behnken试验设计方案与响应面分析

2.2.1 Box-Behnken试验结果

根据单因素试验结果，选择萃取压力（X1）、萃取温度（X2）、静态萃取时间（X3）为考察因素，以萃取率（Y）为响应值进行Box-Behnken试验设计，15 个试验点的试验结果见表3。15 个试验点分为2 类：1～12为析因点；13～15为区域的中心点，用以估计试验误差[22]。

表3 Box-Behnken试验设计及结果Table 3 Box-Behnken experimental design arrangement and experimental resuullttss

2.2.2 模型的建立及显著性检验

用SAS 9.2统计学软件对表3中的试验结果进行回归拟合分析，得鲍鱼内脏油脂萃取率与各因素变量的多元二次回归方程为：

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance

2.2.3 响应因子水平的优化

由图5可知，X1、X2和X3存在极值点，为进一步验证最佳点的值，对回归方程求一阶偏导并整理得方程组（4）～（6）：

解方程组（4）～（6）得：X1=3 1.2 3 1 4、X2=42.268 1、X3=9.365 1。代入回归方程，解得预测的萃取率为75.338 07%。考虑到实际操作性，将鲍鱼内脏油脂的最佳萃取条件修正为：萃取压力31.2 MPa、萃取温度42.3 ℃、静态萃取时间9.4 min。在此修正条件下的实际萃取率为75.23%，与预测值相差不大，证明模型有效。

图5 各两因素交互作用对鲍鱼内脏油脂萃取率影响的响应面和等高线图Fig.5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of three extraction conditions on oil yield

2.3 脂肪酸分析

按上述优化的萃取方法获得的鲍鱼内脏油脂经皂化后，通过超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱检测，MassLynx 4.1软件分析，得到总离子流图（图6）。总离子流图上的每一个点都对应一张质谱图。以保留时间3.332 min为例，将峰进行积分，得到质谱图（图6）。该保留时间处离子强度最大的质荷比为225.185 2和275.200 5。用MassLynx 4.1软件可对由四极杆-飞行时间-高分辨质谱得到的质荷比对应的分子式进行预测。以质荷比为225.185 2为例，已知脂肪酸的元素组成为C、H、O，分析显示，质荷比225.185 2对应的分子式只有一种可能，为C14H25O2，考虑到C14H25O2是其对应的脂肪酸减H形成的负离子，所以质荷比225.185 2对应的脂肪酸为C14H26O2。同理，质荷比275.200 5对应的脂肪酸为C18H28O2。精确质荷比得到的可能的分子式范围大大缩小，从而在很大程度上提高了分子式预测的准确性，但仅凭分子式只能计算分子的不饱和度，若需要明确双键的位置还需要其他手段。

图6 鲍鱼内脏油脂脂肪酸总离子流图和质谱图Fig.6 Total ion current chromatogram and mass spectrum of fatty acids from abalone visceral oil

表5 鲍鱼内脏油脂脂肪酸的组成Table 5 Fatty acid composition from abalone visceral oil

利用四极杆-飞行时间-质谱高分辨得到的质荷比数据，对相应的质荷比对应的分子式进行预测，结果见表5。由表5可知，依据碳链长度和双键数目的不同，鲍鱼内脏油脂含有脂肪酸39 种，碳链长度在C12～C24，双键数目在0～7，其中饱和脂肪酸有9 种，单不饱和脂肪酸有8 种，多不饱和脂肪酸有22 种。本实验通过精确质荷比预测脂肪酸的分子式，未确定双键位置的具体信息，因此未能将脂肪酸的同分异构体进行区分。

气相色谱-质谱得到可能的脂肪酸组成信息在表5的最后一列体现。将气相色谱-质谱得到的质谱图进行数据库检索，共检测到21 种脂肪酸。其中多种脂肪酸存在同分异构体，如十六碳单烯酸有2 种，十八碳单烯酸有2 种。有25 种液相色谱-质谱法检测到的脂肪酸未在气相色谱-质谱系统检测到，如十二碳烷酸和二十二碳三烯酸等。

本实验使用液相色谱-质谱和气相色谱-质谱2 种方法检测鲍鱼内脏中的脂肪酸，由表5可知，尽管不能得到脂肪酸同分异构体的信息，液相色谱-质谱仍能检测到更多种类的脂肪酸。此外，气相色谱-质谱法需要先将脂肪酸进行甲酯化处理，而液相色谱-质谱法可直接分析检测脂肪酸。

无论是液相色谱-质谱法的精确质荷比进行分子式预测，还是气相色谱-质谱法的数据库检索，所提供的都只是可能的脂肪酸结构信息，若需确定每种脂肪酸的确切结构，还需要二级质谱检测[23]和标准品比对[24]等手段。

3 结 论

通过SAS 9.2统计学软件的响应面分析，对超临界CO2萃取鲍鱼内脏油脂条件进行优化，得出最佳萃取条件为：萃取压力31.2 MPa、萃取温度42.3 ℃、静态萃取时间9.4 min，鲍鱼内脏油脂的萃取率可达75.23%。

超临界CO2萃取获得的鲍鱼内脏油脂中共检测出39 种脂肪酸，碳链长度在C12～C24，双键数目在0～7，其中饱和脂肪酸9 种、单不饱和脂肪酸8 种、多不饱和脂肪酸22 种。

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Optimization of Supercritical CO2Extraction of Abalone Visceral Oil by Response Surface Methodology and Analysis of Fatty Acid Composition

TANG Peng1, DUAN Haixia2, XIA Jinmei3,*, WENG Wuyin1, LI Qian3, XU Jianzhong3, LIN Yi3, XU Chen3

(1. College of Food and Biological Engineering, Jimei University, Xiamen 361021, China; 2. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China; 3. Key Laboratory of Marine Biogenetic Resources, Third Institute of Oceanography, State Oceanic Administration, Xiamen 361005, China)

Supercritical CO2was used to extract abalone visceral oil. To optimize the extraction conditions, the statistical software SAS 9.2 was applied to design the experiment with response surface methodology. The impacts of pressure, temperature, and time on extractability were investigated. It was found that the optimum extraction pressure, temperature and time were 31.2 MPa, 42.3 ℃ and 9.4 min, respectively. The extraction rate was 75.23% under the optimized conditions. Ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS) was then used to analyze the extracted oil. A total of 39 fatty acids with different lengths of carbon chain and numbers of double bonds were detected, including 9 kinds of saturated fatty acids, 8 kinds of monounsaturated fatty acids and 22 kinds of polyunsaturated fatty acids.

supercritical CO2; response surface methodology; abalone viscera; mass spectrometry

TS225.6；TS224.4

A

1002-6630（2015）12-0153-07

10.7506/spkx1002-6630-201512029

2014-11-01

厦门市海洋经济发展专项资金项目（13CZP003HJ05）；海洋公益性行业专项（201105029）；

国家重大科学仪器设备开发专项（2013YQ170525）

汤鹏（1987—），男，硕士研究生，主要从事鲍鱼内脏多糖的分离纯化研究。E-mail：tp.gaint@163.com

*通信作者：夏金梅（1981—），女，助理研究员，博士，主要从事海洋生物代谢组学研究。E-mail：xiajinmei@tio.org.cn