替米沙坦对肾性高血压大鼠心肌重构的影响

李鑫，冯园园，孙璇璇，李冰

(华中科技大学同济医学院附属协和医院1.药剂科；2.神经内科，武汉 430022)

替米沙坦对肾性高血压大鼠心肌重构的影响

李鑫1，冯园园2，孙璇璇1，李冰1

(华中科技大学同济医学院附属协和医院1.药剂科；2.神经内科，武汉 430022)

目的 探讨替米沙坦对肾性高血压大鼠心肌重构的影响。方法 通过左肾动脉缩窄法建立大鼠肾性高血压心肌肥厚模型，45只雄性斯泼累格·多雷(SD)大鼠随机分为假手术组、模型对照组和替米沙坦组，每组15只。替米沙坦组灌胃替米沙坦10 mg·kg-1·d-1，假手术组、模型对照组灌胃等量纯化水。灌胃8周后，心脏超声诊断仪观察心脏结构和功能，测定血压，计算左心室质量指数，并检测血清中钙调神经磷酸酶(CaN)含量以及心肌β-肌球蛋白重链(β-MHC)mRNA的表达。结果 模型对照组和替米沙坦组左心室射血分数分别为(69.23±1.09)%和(73.77±3.00)%(P<0.05)；缩短分数分别为(30.21±2.02)%和(35.29±0.90)%(P<0.05)；左心室质量指数分别为(2.83±0.14)和(2.32±0.11)mg·g-1(P<0.05)。与模型对照组比较，替米沙坦组外周循环血液中CaN以及心肌组织中β-MHC mRNA的表达均下降(均P<0.05)。结论 替米沙坦可有效逆转由肾性高血压引起的心肌肥厚，并可能通过抑制起始信号CaN的活化，作用于下游信号通路，下调心肌蛋白相关基因β-MHC的表达。

替米沙坦；高血压，肾性；心肌重构；钙调神经磷酸酶；β-肌球蛋白重链

肾性高血压患者肾脏缺血，导致肾素分泌增加，肾素-血管紧张肽-醛甾酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)过度活化，激活Ras信号通路，可出现心肌重构现象，导致心肌肥厚。替米沙坦是一种血管紧张肽抑制剂类药物，可抑制Ras、P38、JNK、ERK等信号通路激活，阻断心肌蛋白合成[1-3]。替米沙坦可预防和改善压力性心室负荷引起的心肌肥厚，具有降压和维持心功能的作用[4-5]，关于其作用机制有很多研究[6-8]，但是关于替米沙坦对心肌肥厚过程中起始信号的作用鲜有报道，这些分子机制的研究都比较单一而且缺乏系统性，对替米沙坦是通过怎样的途径来抑制该信号通路尚不清楚，因此笔者建立大鼠肾性高血压模型，探讨替米沙坦对大鼠心肌肥厚过程中的起始信号血清中钙调神经磷酸酶(calcineurin，CaN)以及其标志蛋白β-肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain，β-MHC)表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级健康雄性斯泼累格·多雷(Sprague Dawley，SD)大鼠45只，体质量(250±20)g[购于山东鲁抗医药股份有限公司实验动物中心，合格证号：0010232，使用许可证号：SYXK(鲁)2013-0002]，分笼以常规饲料、常温条件下饲养，相对湿度40%～70%，保持环境清洁。手术前禁食12 h，不禁水。

1.2 试剂与仪器 替米沙坦片(天津怀仁制药有限公司，批准文号：国药准字H20041938，规格：每片40 mg)，CaN 酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(上海凯博生化试剂有限公司，规格：96T/48T，批号：KB2753)，Trizol试剂盒(美国 Invitrogen，批号：15596-026)，RT-PCR试剂盒、PCR引物、DNA Marker(日本 TaKaRa，批号：3427A)，琼脂糖粉(上海海博生化试剂有限公司)。Vevo707超声诊断仪(VisualSonics 公司)，MPA2000M测压系统(奥尔科特公司)。

1.3 动物分组与模型建立 将45只大鼠用随机数字表法随机分为3组：假手术组、模型对照组和替米沙坦组，每组15只。

10%水合氯醛(3 mL·kg-1)腹腔注射麻醉大鼠，剪开腹腔，钝性分离左肾，游离出左肾动脉，替米沙坦组、模型对照组大鼠套入内径为0.2 mm的银夹进行缩窄手术，假手术组只游离左肾动脉，不缩窄。手术后2周，替米沙坦组、模型对照组收缩压>150 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)为造模成功。造模成功后，替米沙坦组灌胃给予替米沙坦10 mg·kg-1·d-1，假手术组、模型对照组灌胃等量纯化水。每天1次，连续8周。

1.4 心脏结构与功能测定 在灌胃8周后通过超声诊断仪和高频探头检测心脏结构和功能，其指标包括左心室收缩期前壁厚度(left ventricular anterior wall thickness end-systolic，LVAWs)、左心室舒张期前壁厚度(left ventricular anterior wall thickness end-diastolic，LVAWd)、左心室收缩期后壁厚度(left ventricular posterior wall systolic thickness，LVPWs)、左心室舒张期后壁厚度(left ventricular posterior wall diastolic thickness LVPWd)、左心室收缩期内径(left ventricular end systolic diameter，LVIDs)、左心室舒张末期内径(left ventricular end diastolic diameter，LVIDd)、左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)、缩短分数(left ventricular fractional shortening，LVFS)。

1.5 血压与左心室质量指数测定 灌胃8周后大鼠称质量后麻醉，固定，开腹，分离腹主动脉，经腹主动脉插管，通过生物信号仪系统记录主动脉收缩压(systolic blood pressure，SBP)和主动脉舒张压(diastolic blood pressure，DBP)。取下心脏，分离左心室及间隔，称质量，计算左心室质量指数(left ventricular mass index，LVMI)：LVMI(mg·g-1)=左心室质量/体质量。

1.6 CaN检测 灌胃8周后，大鼠麻醉后经腹主动脉取血(5～6 mL)，1 500 r·min-1(r=13.5 cm)离心10 min，取血清，根据CaN ELISA试剂盒说明制作标准曲线，计算CaN含量。

1.7 心肌组织中β-MHC mRNA的表达 Trizol法提取心肌组织总RNA，按照RT-PCR试剂盒说明在M-MVL 酶作用下进行反转录得到cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。β-MHC引物序列如下：上游：5′-CTG GCA CCG TGG ACT ACA AC-3′，下游：5′-CGC ACA AAG TGA GGA TAG GGT-3′，长度为268 bp。以β- actin为内参引物，上游序列： 5′-CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC-3′，下游序列： 5′-TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3′，扩增产物大小为150 bp。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色，Bio-Rad Co.生物医学图像分析系统分析条带密度。

2 结果

2.1 超声心动图比较 灌胃8周后，与假手术组比较，模型对照组左室壁厚度(LVAWs、LVAWd、LVPWs、LVPWd)均明显增加，两组差异有统计学意义(t值分别为1.231，1.452，2.124，1.973，P<0.05)；替米沙坦组左室壁厚度下降，LVEF和LVFS上升，与模型对照组比较差异具有统计学意义(t值分别为1.346，1.682，2.089，1.909，3.324，5.008，P<0.05)。与模型对照组比较，假手术组与替米沙坦组的LVIDs、LVIDd较小，但差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 血压及LVMI测定结果 灌胃8周后，与假手术组比较，模型对照组血压明显升高(t=5.379，P<0.05)，替米沙坦组血压下降明显，且与模型对照组比较差异有统计学意义(t=4.904，P<0.05)。与模型对照组比较，替米沙坦组LVMI明显下降，差异有统计学意义(t=2.076，P<0.05)，而与假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.3 血清中CaN检测结果 在灌胃8周后，假手术组、模型对照组和替米沙坦组血清CaN分别为(3.02±0.30)，(7.92±0.40)，(3.08±0.05) μg·L-1。与模型对照组比较，替米沙坦组外周循环血液中CaN明显下降(t=7.123，P<0.05)，而替米沙坦组和假手术组之间差异无统计学意义。

2.4 心肌组织中β-MHC mRNA的表达 模型对照组β-MHC mRNA的表达条带密度(0.89±0.23)，较假手术组(0.34±0.09)升高，替米沙坦组(0.37±1.03)表达量明显降低，与模型对照组比较差异有统计学意义(t=3.121，P<0.05)。

3 讨论

替米沙坦通过阻断AngⅡ与AT1受体结合，逆转左心室重构，改善心功能[9-10]。替米沙坦逆转心肌肥厚是一个复杂的信号传递过程。研究证明CaN在心肌肥厚过程中起着起始信号的作用，其表达水平早于心肌重构，它可以启动一系列反应使心肌细胞内Ca2+超载，从而表达一些胚胎性心肌蛋白[11-12]。其中左心室压力负荷增加，受到机械张力或内分泌因子刺激后，可导致β-MHC基因的再表达[13-14]，因此本研究对心肌肥厚过程中具有代表性的信号和基因表达水平进行检测，探讨其可能的作用机制。

心肌肥厚是由于心肌细胞中蛋白合成增加而导致心肌细胞增大增重、间质细胞增殖。心肌肥厚使心肌耗氧量增加、顺应性降低，严重时导致心力衰竭[15-17]。本研究采用左肾动脉缩窄法成功建立肾性高血压大鼠心肌肥厚模型，模型对照组与假手术组比较，左心室壁厚度、LVMI增大，LVEF、LVFS下降，血压升高，而给予替米沙坦治疗8周后，左心室壁厚度、LVMI减小，LVEF、LVFS增加，且血压降低，说明了替米沙坦可以改善心脏功能，降低血压，有效逆转心肌肥厚，其原因可能是通过降低血压减轻心脏室壁所受到的压力。本研究显示，模型对照组CaN的表达量明显高于假手术组，而替米沙坦组CaN的表达量明显降低，从而抑制心肌细胞内Ca2+超载现象，而Ca2+可介导心肌细胞增大以及肌纤维增生。同时β-MHC mRNA的水平也明显下降，由于肌球蛋白是心肌主要蛋白，参与肌丝构成，而β-MHC被视为心肌肥厚的分子标志[18]，β-MHC mRNA的水平增高，肌球蛋白ATP酶活性降低，不能为心肌收缩提供足够的能量，心肌收缩力降低，从而导致心肌肥厚。以上的研究说明替米沙坦可能通过阻断AngⅡ与AT1受体的结合而使外周循环中CaN的表达量降低，作用于下游信号通路，下调β-MHC的表达，从而抑制心肌细胞的增殖肥大。

表1 3组大鼠超声心动图指标比较

与模型对照组比较，*1P<0.05Compared with model control group，*1P<0.05

表2 3组大鼠血压和LVMI比较

与模型对照组比较，*1P<0.05Compared with model control group，*1P<0.05

综上所述，替米沙坦可有效逆转由肾性高血压引起的心肌肥厚，并可能通过抑制起始信号CaN的活化，下调心肌蛋白相关基因β-MHC的表达。

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Effect of Telmisartan on Myocardial Remodeling in Rats with Renovascular Hypertention

LI Xin1，FENG Yuanyuan2，SUN Xuanxuan1，LI Bing1

(1.DepartmentofPharmacy;2.DepartmentofNeurology，UnionHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430022，China)

Objective To investigate the the molecular mechanism of telmisartan for myocardial remodeling in rats with renovascular hypertention. Methods The renovascular hypertensive myocardial hypertrophy model of rats were established by narrowing the left renal artery.The total of 45 mature male SD rats were divided into sham-operated group(n=15)，model control (n=15) and telmisartan group (n=15) randomly.The rats in telmisartan group were treated with telmisartan (10 mg·kg-1·d-1) while those in the sham-operated and model control were reated with the same amounts of distilled water by intragastrical administration .At 8th week of administration，the myocardial structure and function were detected by ultrasonography.The blood pressure was measured by arterial catheterization and calculating the left ventricular mass index (LVMI) .The level of serum calcium and nerve phosphatase (CaN) and the expression of β-myosin heavy chain (β-MHC) mRNA were detected. Results The thickness of left ventricular，ejection fraction[(69.23±1.09)%vs(73.77±3.00)%]，fractional shortening[(30.21±2.02)%vs(35.29±0.90)%]，LVMI[(2.83±0.14) mg·g-1vs(2.32±0.11) mg·g-1] were decreased，and the differences were statistically significant (P<0.05).The level of serum calcium and nerve phosphatase (CaN) and the expression of β-myosin heavy chain (β-MHC) mRNA were decreased in telmisartan treated rats，and the differences were statistically significant (P<0.05) when compared with the model control group. Conclusion Telmisartan can improve the myocardial hypertrophy of renovascular hypertensive rats，and it may downregulate the expression of β-MHC by inactivating of the start signal CaN and its downstream signal pathway.

Telmisartan; Hypertension，renovascular; Myocardial remodeling; Calcium and nerve phosphatase; β-myosin heavy chain

2014-09-08

2014-11-18

李鑫(1983-)，男，湖北荆门人，药师，硕士，从事医院药学工作。电话：027-85351733，E-mail：46648856lixin@163.com。

冯园园(1985-)，女，湖北宜昌人。电话：027-85726670，E-mail：934728115@qq.com。

R972.4；R965

A

1004-0781(2015)09-1161-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.09.010