丹皮总苷对急性心肌缺血损伤小鼠的保护作用*

徐晓燕，李颖，王伟，王浩，陈伟

(泰山医学院药学院，泰安 271016)

丹皮总苷对急性心肌缺血损伤小鼠的保护作用*

徐晓燕，李颖，王伟，王浩，陈伟

(泰山医学院药学院，泰安 271016)

目的 探讨丹皮总苷对急性心肌缺血缺氧损伤小鼠的保护作用及其机制。方法 小鼠60只，随机分成5组(n=12)，正常对照组、模型对照组(均给予等容量0.9%氯化钠溶液)及丹皮总苷小、中、大剂量组(分别给予丹皮总苷50，100，200 mg·kg-1)，均每天给药1次，连续7 d，末次灌胃后模型对照组及丹皮总苷组小鼠分别腹腔注射15 mg·kg-1异丙肾上腺素复制心肌缺血模型。测定动物心电图T波和J点的变化及血清乳酸脱氢酶(LDH)、心肌组织中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的变化，并通过Nagar-Olsen染色观察丹皮总苷对心肌缺血的影响。结果 丹皮总苷可明显降低小鼠心电图T波及J点的位移，并可改善心肌缺血小鼠相关生化指标。与模型对照组比较，丹皮总苷大剂量组LDH活力[(898.992±285.108) μmol·mg-1]和MDA含量[(11.737±5.162) nmol·mg-1]均明显降低，心肌SOD活力[(45.505±20.711) U·mg-1]明显升高，缺血心肌面积显著缩小。结论 丹皮总苷对急性心肌缺血小鼠具有保护作用。

丹皮总苷；缺血，心肌，急性；保护作用

丹皮为毛茛科植物牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)的干燥根皮，具有清热凉血、活血化瘀之功效。丹皮总苷是从丹皮中提取的活性成分，主要包括芍药苷、丹皮苷、丹皮原苷、丹皮新苷等苷类化合物，具有广泛的生物活性[1-4]。丹皮总苷可提高小鼠在缺氧状态下的存活率和存活时间，提高心脑的抗缺氧能力，对垂体后叶素致心肌缺血具有保护作用，笔者通过建立异丙肾上腺素致小鼠急性心肌缺血模型，考察丹皮总苷对急性心肌缺血小鼠心电图及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)的影响，进一步研究其对心肌缺血的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 昆明种小鼠，雌雄兼用，体质量18～22 g，由泰山医学院实验动物中心提供，合格证号：鲁动质字020103，使用许可证号： SYXK(鲁)20120005，饲养环境的室温(22±2) ℃，相对湿度(45±15)%，光照、黑暗交替12 h，自由摄食普通饲料和饮水。

1.2 药品与试剂 丹皮饮片，批号：20110301033，购自泰安市金泰联医药公司；异丙肾上腺素，上海禾丰制药有限公司，批号：100701；芍药苷对照品，中国食品药品检定研究院，批号：20110407；LDH、SOD、MDA及考马斯亮兰蛋白测试盒(南京建成生物工程研究所，批号：20110411)。

1.3 仪器 BL-420生物机能实验仪(成都泰盟仪器有限公司)；RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SHB-95A型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；Bio-rad680酶标仪(美国伯乐公司)；S-54紫外分光光度仪(上海校光技术有限公司)；凯特离心机(盐城凯特实验仪器有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 丹皮总苷的提取和含量测定 将丹皮饮片与75%乙醇拌匀浸润(料液比1：5)10 h后，回流提取3次，干燥，得粗品。粗品经D-101大孔树脂纯化后，得样品供实验使用[5]。以芍药苷为对照品，10%变色酸为显色剂，测得所提样品中丹皮总苷的含量为74.65%。

1.4.2 动物分组、给药及模型复制 将小鼠60只随机分成5组，每组12只。丹皮总苷小、中、大剂量组分别给予丹皮总苷50，100，200 mg·kg-1；正常对照组及模型对照组给予等容量0.9%氯化钠溶液，每天1次，连续7 d。末次给药30 min后腹腔注射乌拉坦1.3 g·kg-1麻醉，用BL-420生物机能实验系统描记小鼠标准肢体Ⅱ导联正常心电图，正常对照组小鼠腹腔注射等容量0.9%氯化钠溶液，其余组小鼠腹腔注射异丙肾上腺素15 mg·kg-1。连续记录腹腔注射异丙肾上腺素后2，5，10 min心电图，观察并比较给药后心肌缺血小鼠J点电压变化，每时间点测3个连续的波型，取其平均值[6-7]，并以PR段为基线记录各组小鼠Ⅱ导联心电图J点位移(mV)及T波的位移变化。

1.4.3 实验动物的处理 小鼠造模20 min后摘眼球取血，830×g离心，取血清测定LDH。处死小鼠，取心脏，用0.9%氯化钠溶液洗净残留的血液，滤纸吸干称重，冰浴下制成5%组织匀浆，830×g离心10 min，取上清液，测定心肌组织MDA、SOD。取小鼠心脏，固定于10%甲醛溶液，进行病理学检查。

1.4.4 Nagar-Olsen染色观察心肌病理改变 心肌组织切片常规脱蜡入水，入明矾苏木精液10～30 s，纯化水洗，碱性复红染液浸染3 min，纯化水、丙酮依次洗涤，0.1%苦味酸丙酮液分化5～10 s。丙酮脱水，二甲苯透明，中性树胶封片[8]。

2 结果

2.1 丹皮总苷对心肌缺血小鼠心电图的影响

2.1.1 丹皮总苷对心肌缺血小鼠T波的影响 腹腔注射异丙肾上腺素后2 min，模型对照组小鼠T波较正常对照组有明显位移，位移幅度超过0.1 mV(t=4.057，P<0.01)，10 min时，T波位移有所减小，但仍超过0.1 mV。与模型对照组比较，大剂量丹皮总苷能对抗注射异丙肾上腺素所致的T波位移(t=2.241～6.404，P<0.05或P<0.01)。结果见表1。

表1 5组小鼠不同时间心电图T波位移比较

与正常对照组比较，*1P<0.01，与模型对照组比较，*2P<0.05，*3P<0.01Compared with normol control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01

2.1.2 丹皮总苷对心肌缺血小鼠J点的影响 腹腔注射异丙肾上腺素后2 min，与正常对照组比较，模型对照组小鼠心电图J点明显位移，位移幅度超过0.1 mV，10 min时位移继续增加，没有恢复(t=5.494，P<0.01)。与模型对照组比较，丹皮总苷大、中剂量组心电图J点的位移显著降低(t=2.690～3.475，P<0.05或P<0.01)。结果见表2。

表2 5组小鼠不同时间心电图J点位移比较

与正常对照组比较，*1P<0.01，与模型对照组比较，*2P<0.05，*3P<0.01Compared with normol control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01

2.2 丹皮总苷对心肌缺血小鼠血清LDH的影响 正常对照组、模型对照组和丹皮总苷小、中、大剂量组血清LDH含量分别为(900.000±403.131)，(1 645.941±387.824)，(1 164.219±454.525)，(932.332±408.475)，(898.992±285.108)μmol·mg-1。与正常对照组比较，模型对照组LDH上升(t=3.528，P<0.01)；与模型对照组比较，丹皮总苷中、大剂量组血清LDH明显降低(t=3.352，P<0.01)。

2.3 丹皮总苷对心肌缺血小鼠心肌组织MDA、SOD的影响 与正常对照组比较，模型对照组小鼠心肌组织MDA含量升高(t=3.583，P<0.01)，SOD活力明显下降(t=3.452，P<0.01)，与模型对照组比较，丹皮总苷中、大剂量组的心肌组织中MDA明显降低，SOD活力明显升高，差异有统计学意义(t=2.569～3.379，P<0.05或P<0.01)。见表3。

表3 5组小鼠心肌组织中MDA、SOD含量比较

与正常对照组比较，*1P<0.01，与模型对照组比较，*2P<0.01，*3P<0.05Compared with normol control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.01，*3P<0.05

2.4 丹皮总苷对小鼠心肌组织Nagar-Olsen染色的影响 Nagar-Olsen染色可以将缺血早期的心肌染成红色，从而分辨心肌缺血的早期改变。结果可见，正常对照组心肌组织呈黄染，模型对照组缺血心肌呈红染。与模型对照组比较，丹皮总苷大剂量组心肌红染面积显著减少，黄染面积增多；而丹皮总苷小剂量组虽有部分组织黄染，但仍可见大片红染的心肌组织。随着丹皮总苷剂量的增加，小鼠的心肌缺血红染面积逐渐减少。见图1。

3 讨论

心肌持续缺血将导致心肌组织损害，并出现ST段、T波缺血性改变，即J点位移，ST段抬高或降低0.1 mV以上，T波高耸或低平均可视为心肌缺血的心电图表现[9]。异丙肾上腺素为β-受体激动药，大剂量注射可通过增加心脏做功，增加心肌耗氧量，使心肌能量代谢发生障碍，导致心肌损伤、坏死，同时由于心肌细胞膜损伤，使心肌细胞内LDH等释放入血增加[10]。本实验结果显示，小鼠腹腔注射大量异丙肾上腺素后心电图J点和T波都有明显位移；血清LDH明显增加；Nagar-Olsen染色出现大面积红染现象，提示心肌缺血模型塑造成功。与模型对照组比较，丹皮总苷组心电图的J点和T波位移幅度明显变小，血清LDH显著降低，缺血红染面积明显缩小，表明丹皮总苷对小鼠缺血性损伤心肌具有保护作用，且这种保护作用呈现一定的剂量依赖关系。

心肌缺血时可产生大量氧自由基，从而导致脂质过氧化反应，产生脂质过氧化物，进一步代谢生成MDA，这些脂质自由基将加剧缺血心肌组织损伤[11]。本实验结果可以看出，对异丙肾上腺素所致的脂质过氧化，丹皮总苷能明显提高小鼠心肌的SOD活性，增强了内源性氧自由基清除系统的功能，显著降低心肌MDA的含量。提示丹皮总苷可能是通过减少脂质过氧化，提高心肌SOD的活性，抑制氧自由基的产生，提高心肌的抗氧化能力，改善心肌的能量代谢，从而发挥其抗心肌缺血的保护作用。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.丹皮总苷小剂量组；D.丹皮总苷中剂量组；E.丹皮总苷大剂量组

A.normal control group；B.model control group；C.low- dose TGM group；D.middle- dose TGM group；E.high-dose TGM group

Fig.1 Nagar-Olsen staining on myocardial tissue in five groups of mice(×100)

[1] 李惠芬，杜凡，周静，等.牡丹皮中丹皮酚、总苷、多糖单用及合用后的协同抑菌作用考察[J].天津药学，2008，20(2)：10-12.

[2] 胡红宇，杨郁，于能江，等.牡丹皮的化学成分研究[J].中国中药杂志，2006，31(21)：1793-1794.

[3] 洪浩，王钦茅，赵帜平，等.丹皮多糖-2b对2型糖尿病大鼠的抗糖尿病作用[J].药学学报，2003，38(4)：255-256.

[4] 孙国平，沈玉先，张玲玲，等.丹皮酚的体内外抗肿瘤作用[J].安徽医科大学学报，2002，37(3)：183-184.

[5] 赵新峰，王伟，孙毓庆.毛细管区带电泳法测定牡丹皮中芍药苷的含量[J].中草药，2003，34(3)： 271-272.

[6] 何勇.黄芪提取物对心肌缺血损伤的保护作用[J].中药新药与临床药理，2008，19(2)：100-102.

[7] 范丽，袁丽萍，陈志武，等.黄蜀葵花总黄酮对小鼠急性心肌缺血缺氧损伤的保护作用[J].中国药房，2005，16(3)：176-177.

[8] 王伯沄.病理学技术[M].北京：人民卫生出版社，2001：149.

[9] 陈清启.ST 段改变与测量方法[J].临床心电学杂志，2005，8(3)：162-163.

[10] 张玲，龙子江，王靓，等.双丹注射液对急性心肌缺血模型大鼠心电图与血清酶的影响[J].中药药理与临床，2006，22(6)：55-56.

[11] 高建，王秋娟，唐玉，等.银杏内酯对异丙肾上腺素致心肌损伤的影响[J].中药新药与临床药理，2004，15(3)：151-154.

Protective Effect of Total Glucosides of Mudan Cortex on Acute Myocardial Ischemia in Mice

XU Xiaoyan，LI Ying，WANG Wei，WANG Hao，CHEN Wei

(SchoolofPharmacy，TaishanMedicalCollege，Taian271016 ，China)

Objective To study the protective effect of total glucosides ofMudancortex(TGM)on acute myocardial ischemia in mice and its mechanism. Methods The total of 60 mice were randomly divided into 5 groups (n=12)，normal control and model control (were given equal capacity of 0.9% sodium chloride solution)，and TGM at low，middle，high dose (were given with 50，100，200 mg·kg-1TGM).The mice were administered once daily for consecutive seven days.After the last administration，the mice in the model control and drug groups were treated by intraperitoneal injection of 15 mg·kg-1isoproterenol to to make myocardial ischemia animal model.TGM on the T wave and J point on ECG，and serum lactate dehydrogenase (LDH)，myocardial tissue superoxide dismutase (SOD)，malondialdehyde (MDA) changes was detected，and the extent of myocardial ischemic injury in mice was measured by Nagar-Olsen staining. Results TGM significantly reduced the displacement of ECG T wave and J point，and improved the related biochemical indexes in mice with myocardial ischemia.The activity of LDH[(898.992± 285.108) μmol·mg-1] ，the content of MDA[(11.737 ±5.162) nmol·mg-1]in mice treated with TGM at high dose obviously decreased in comparison to the model controls，and the activity of myocardial SOD[(45.505±20.711) U·mg-1] significantly elevated compared with the model control.It was showed that TGM significantly diminished the areas of cardiac muscles ischemia injured via Nagar-Olsen staining. Conclusion TGM has the remarkable protective effect on acute myocardial ischemia injury in mice.

Total glucosides ofMudancortex(TGM) ; Ischemia，myocardial，acute; Protective effect

2014-09-29

2014-11-09

*山东省高等学校科技计划项目(J14LM52)

徐晓燕(1977 -)，女，山东滕州人，讲师，硕士，主要从事药理学教学与科研。电话：0538-6229751，E-mail：xyxu@tsmc.edu.cn。

R282.71；R285.5

A

1004-0781(2015)09-1158-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.09.009