阳和化岩汤对大鼠乳腺癌癌前病变细胞超微结构的影响*

金妙妙 傅健飞

（浙江省金华市中心医院，浙江 金华 321000）

·研究报告·

阳和化岩汤对大鼠乳腺癌癌前病变细胞超微结构的影响*

金妙妙 傅健飞

（浙江省金华市中心医院，浙江 金华 321000）

目的观察阳和化岩汤对大鼠乳腺癌癌前病变后细胞形态学改变情况。方法选取大鼠30只建立大鼠乳腺癌癌前病变模型，另取10为空白组，9周后进行分组并采取不同药物干预4周，观察大鼠肿瘤出现情况，取乳腺组织进行HE染色观察组织病理形态学变化，在透射电镜下观察细胞超微结构。结果大鼠组织形态学上，空白对照组全部为一般增生，为100.00%，与阳和化岩汤、平消片组、模型组在一般增生、癌前病变、浸润性癌发生率上比较差异有统计学意义（P＜0.05）。在表面结构、细胞核、细胞凋亡和肌上皮超微表现上，模型组和其他3组在评分上比较差异有统计学意义（P＜0.05），阳和化岩汤组和空白对照组、模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。细胞器和胞质内含物超微表现进行比较，模型组和阳和化岩汤组、空白对照组在评分上比较差异有统计学意义（P＜0.05），阳和化岩汤组和空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论阳和化岩汤具有抑制大鼠乳腺癌前病变细胞生长和代谢功能，主要是细胞膜、细胞质和细胞核超微结构发生不同程度变化。

阳和化岩汤 大鼠 乳腺癌 癌前病变 超微结构

乳腺癌癌前病变是乳腺癌发展的必然经过，但在临床上予合适的措施进行阻断和干预，能提高乳腺癌预后。研究称，乳腺癌前病变在治疗上方法较多，最常见的是药物干预治疗，其中以中医药干预报道最常见，其临床有效率占60%以上［1］，目前临床上着重报道的是中医药在宏观上对乳腺癌癌前病变作用，很少从微观角度进行分析。本次研究通过观察阳和化岩汤对大鼠乳腺癌癌前病变后细胞形态学改变，以期从微观上进行分析。

1 资料与方法

1.1 实验动物 雌性未育大鼠，鼠龄6周左右，体质量为220~240 g，共40只，采用山东大学实验室提供的饲料，均由上海复旦大学动物实验室提供，许可证为SCXK（沪）2013002，试验动物许可证为SYXK（沪）20130017，均经相关部位同意后进行研究。

1.2 试药与仪器 阳和化岩汤，药物组成：鹿角霜12 g，熟地黄10 g，肉桂6 g，莪术10 g，山慈菇15 g，浙贝母10 g，肉桂6 g，白芥子3 g，甘草6 g。平消片（宁夏金太阳药业有限公司，国药准字Z64020166，0.23 g/片，主要成分：郁金、仙鹤草、五灵脂、白矾、硝石、干漆、枳壳、马钱子粉）。二甲基苯并蒽（上海宝曼生物科技有限公司，生产批号为2012-3-13）。透视电子显微镜由日本西门子公司提供，电子显微镜型号为81W/AIS2100。

1.3 造模与给药 造模大鼠分3次灌注二甲基苯并蒽，每次剂量为50 mg/kg，周期为3周1次，共9周。造模成功后分成3组，每组10例，另取10只为空白对照组，予饮用水常规饲养。阳和化岩汤组予中药汤剂取汁200 mL，以20 mL/kg灌胃，连续4周。平消片组予平消片6片溶于0.9%氯化钠注射液200mL中，用药剂量等同中药组。造模组则造模成功后予饮用水，常规饲养。

1.4 标本采集与检测 取正常大鼠第2对乳房，出现肿瘤组则取肿瘤组织，直径约为0.5 cm，浸入10%甲醛中固定1 d，然后取材、脱水、透明、浸蜡、包埋后切片，常规HE染色，中性树胶封片。然后取新鲜组织，快速用PB冲洗后放入3%戊二醛固定液中，将样品修复成1 mm×1 mm×2 mm，置于新鲜3%戊二醛，常规TEM样品制备漂洗后固定，漂洗，脱水，浸透，包埋后行超薄切片，用柠檬酸铅和醋酸铀离子染色，在透射电镜下观察。观察内容包括细胞表面结构中的桥粒，缝隙连接，镶嵌连接和微绒毛；细胞器和其内的线粒体、内质网、游离核糖体、微丝和微管、脂滴、溶酶体和胞质内腔；细胞核中的核规则程度、异染色质、核仁和核/浆比例。

1.5 超微结构评分方法 1）细胞表面结构超微评分［2］：微绒毛整齐数量分为多、一般和少3个等级，分别计为3分、2分、1分；细胞间缝隙连接分成良好、一般、差，分别计为3分、2分、1分；桥粒分成丰富、一般、不丰富，分别计为3分、2分、1分。2）细胞器和胞质内含物超微评分［3］：线粒体、微丝微管形态分成正常、一般、差，分别计为3分、2分、1分；溶酶体、高尔基复合体分成不发达、一般、发达，分别计为3分、2分、1分；游离核糖体、脂滴数量分为正常、稍多、增多，分别计为3分、2分、1分；胞质内腔分为无、少见、增多，分别计为3分、2分、1分。3）细胞核超微评分［4］：细胞核、染色质、核浆三者正常为3分，一般为2分，差为1分。细胞凋亡和肌上皮超微评分：凋亡体分成未出现、少见和常见，分别计为3分、2分、1分；肌上皮细胞分成正常、不典型和消失，分别计为3分、2分、1分。

1.6 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件分析。计量资料以（±s）检验，组间t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠乳腺组织病理形态学比较 见表1。大鼠组织形态学上，空白对照组全部为一般增生，为100.00%，与阳和化岩汤组、平消片组、模型组在一般增生、癌前病变、浸润性癌发生率上比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 大鼠乳腺组织病理形态学比较n（%）

2.2 大鼠乳腺细胞超微表现评分比较 见表2。在表面结构、细胞核、细胞凋亡和肌上皮超微表现上，模型组和其他3组在评分上比较差异有统计学意义 （P＜0.05），阳和化岩汤组和空白对照组、模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组大鼠乳腺细胞超微表现评分比较（分，±s）

表2 各组大鼠乳腺细胞超微表现评分比较（分，±s）

与模型组比较，*P＜0.05；与阳和化岩汤组比较，△P＜0.05。。

组 别 n 细胞表面结构 乳腺细胞核 乳腺细胞凋亡和肌上皮 乳腺细胞器和胞质内含物空白对照组 11阳和化岩汤组 15平消片组 12 8.56±1.12*△11.67±0.53*△5.84±0.31*△23.15±0.74△6.23±1.54*8.78±2.12*4.55±1.02*16.57±3.45 5.56±1.32*8.24±2.09 4.01±1.04 15.85±4.12模型组 13 4.56±1.14△7.32±1.83△3.79±0.78△14.51±2.15△

图1 阳和化岩汤组大鼠乳腺细胞超微结构图

2.3 大鼠乳腺细胞器和胞质内含物超微表现比较见表2，图1。对大鼠乳腺细胞器和胞质内含物超微表现进行比较，模型组与阳和化岩汤组、空白对照组在评分上比较差异有统计学意义（P＜0.05），阳和化岩汤组和空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨 论

结果显示，在表面结构、细胞核、细胞凋亡和肌上皮超微表现上，空白对照组大鼠细胞表面结构评分明显高于其他组，且有明显差异。其在电镜下表现为乳腺导管细胞结构清晰，桥粒丰富，相邻组织间隙连接或镶嵌连接为主，细胞腔内绒毛丰富且整齐，细胞质内细胞器正常，线粒体圆形，体积较小，可见核糖体，高尔基体和游离核糖体不丰富，细胞核规则不明显，核内染色质较少，基底膜连续，肌上皮细胞正常。这点和文献［5］结果是类似的。

结果显示，细胞器和胞内含物中，模型组和平消片比较差异无统计学意义。模型组在乳腺组织HE染色下表现为浸润性乳腺癌，电镜吸收超微结构表现为细胞膜去分化改变，微绒毛短平、不整齐，桥粒减少和消失，细胞间紧密连接为主，松散变宽，胞质内细胞器丰富，线粒体增多，体积较大，内质网明显增多且肿胀明显，溶酶体增多，这说明了癌细胞蛋白合成功能较强，胞质内数量明显增加，细胞核中形态不规则，细胞基底膜和肌上皮细胞消失，药物治疗后细胞超微结构改变，特别是阳和化岩汤组，在细胞膜、胞内、胞质等超微结构均有明显改善。

结果显示，阳和化岩汤和其他各组在细胞表面结构上比较差异无统计学意义，而在细胞器和胞内含物上阳和化岩汤比平消片评分较高，在细胞核上也有类似情况。其在乳腺组织HE染色形态学上表现为一般增生和癌前病变，浸润性病变等不同表现，其在电镜下表现为细胞膜结构发育不良和去分化，微绒毛逐渐恢复正常，细胞间连接结构不清，缝隙连接减少，发育不良，这点和报道［6］结果一致，说明了该药物对改善细胞间结构作用显著；细胞质内细胞器丰富，线粒体等增多明显，内质网形态丰富，高尔基体可见大量脂滴和乳蛋白颗粒，细胞核形态大小等规则，可见体积增大，核内常染色体丰富，核浆比例失调，其原因可能是由于药物中贝母等有丰富细胞线粒体效果有关［7］。基底膜连续，肌上皮细胞不同程度异常，可加凋亡细胞，这可能和中药汤剂具有促进组织新陈代谢有关［8］。总之，该汤剂在改善细胞表面结构和细胞凋亡上和其他药物是类似的，在胞内结构和胞核上，该汤剂则明显优于平消片。总之，阳和化岩汤在改善细胞膜、细胞质、细胞核超微结构上具有明显改善，在抑制大鼠乳腺癌前病变细胞生长和代谢功能上均有较好作用。

［1］ 闵大六，王保太，孟刚，等.乳腺癌和癌前病变中细胞凋亡及其与bcl-2、PCNA表达的关系［J］.临床与实验病理学杂志，2012，15（2）：99-102.

［2］ 李静蔚，刘晓菲，陈宏志，等.温阳散结法干预乳腺癌癌前病变MCF-10AT细胞的生长抑制及诱导凋亡研究［J］.中医药学报，2013，41（4）：41-45.

［3］ 刘晓菲，李静蔚，陈翰翰，等.温阳散结法干预乳腺癌癌前病变MCF-10AT细胞的生长抑制及诱导凋亡研究［C］.//中华中医药学会2013年学术年会论文集，2013：175-178.

［4］ 刘文英，裴晓华.中医药防治乳腺癌癌前病变的研究进展［C］. //第11届全国中医及中西医结合乳腺病学术会议论文集，2012：472-475.

［5］ 李龙山，孙东植，孙抒，等.乳腺癌及其癌前病变中细胞凋亡与p53、bcl-2蛋白的表达［J］.中国肿瘤临床，2013，27（5）：329-332.

［6］ 李永健.乳宁冲剂干预MCF-10AT细胞及其乳腺癌癌前病变模型的实验研究［D］.上海：上海中医药大学，2012.

［7］ 邓卫芳.化瘀解毒法对乳腺癌癌前病变大鼠SDF-1/CXCR4轴表达的影响［C］.//2012年中医外科学术年会论文集，2012：182-186.

［8］ 李颖嘉，孙学刚，文戈，等.乳腺癌及癌前病变血管生成相关分子的表达及意义［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2012，18（3）：316-321.

The Effect of Yanghe Huayan Tang on the Ultrastructure of Precancerous Iesions Cell of Breast Cancer in Rat

JIN Miaomiao，FU Jianfei.Jinhua Central Hospital of Zhejiang Province，Zhejiang Jinhua 321000，China

Objective：to observe the effect of Yanghe Huayan Tang on the histopathological changes of rat after Precancerous lesions of breast cancer.Methods：30 rats were chosen to establish the rat model of precancerous lesions of breast cancer.Another 10 rats were in the control group.9 weeks later，the rats were divided into groups，and different medicines were taken to intervene，lasting for 4 weeks.Rats were observed in body mass and tumor growth situations.The breast tissue was taken to observe the histopathological changes of HE staining and the ultrastructure of cell with the TEM.Results：In the histomorphology of rats，the control group were all general hyperplasia 100%.There were statistical differences in general hyperplasia，precancerous lesions and the incidence of infiltrating cancer among Yanghe Huayan Tang group，the flat plate group，the model group.In the surface structure，compared with the other 3 groups，the evaluation of the model group had statistical significant differences（P＜0.05）in nucleus，apoptosis and myoepithelial ultra performance.The differences among Yanghe Huayan Tang group，the control group and the model group had statistical meaning（P＜0.05）.In nucleus，apoptosis and myoepithelial ultra performance，the differences among Yanghe Huayan Tang group，the control group and the model group had statistical meaning（P＜0.05）.The differences betweeen Yanghe Huayan Tang group and the control group had statistical meaning（P＜0.05）.Conclusion：Yanghe Huayan Tang has the function of inhibiting the growth and metabolism of the precancerous lesions cells，mainly expressed by the changes of the ultrastructure of membranes，cytoplasm and nucleus in different degrees.

Yanghe Huayan Tang；Rat；Breast cancer；Precancerous lesions；Ultrastructure

R285.5

A

1004-745X（2015）07-1162-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.07.012

2015-03-02）

浙江省自然科学基金资助项目（LY13H190006）