探讨重组人促红细胞生成素改善血管性痴呆大鼠认知功能的可能机制

杨清洁 ，郭军红

探讨重组人促红细胞生成素改善血管性痴呆大鼠认知功能的可能机制

杨清洁1，郭军红2

目的 研究重组人促红细胞生成素(rhEPO)改善血管性痴呆大鼠认知功能的可能作用机制。方法 将30只清洁级雄性SD大鼠，经Morris水迷宫筛选合格后，随机分为5组：假手术组、2VO组、2VO+rhEPO组、2VO+rhEPO+AG490(JAK2抑制剂)组、2VO+AG490组，每组6只。结扎双侧颈总动脉(2VO)建立血管性痴呆模型。造模3 d后，各组分别腹腔给予AG490(5 mg/kg)或等剂量的二甲基亚砜(DMSO，AG490的溶媒)，30 min后鼻腔给予rhEPO (150 U/125 μL)或等量的生理盐水，每周给药1次，共8次。8周后行Morris水迷宫试验检测各组大鼠的空间学习及记忆能力。HE染色观察各组大鼠海马CA1区细胞形态学变化。结果 行为学测试结果，定位航行，随着训练天数的增加，各组大鼠逃避潜伏期明显缩短。2VO+rhEPO组平均逃避潜伏期明显低于2VO组、2VO+rhEPO+AG490组、2VO+AG490组，差异均具有统计学意义(P<0.05)，与假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05)。空间探索实验：2VO + rhEPO组穿越平台次数明显高于2VO组、2VO+rhEPO+AG490组、2VO+AG490组，差异均有统计学意义(P<0.05)。HE染色结果：假手术组海马CA1区细胞排列整齐，细胞形态正常；2VO组海马CA1区细胞排列紊乱，可见胞体萎缩，核深染，核固缩，核溶解；2VO+rhEPO组：海马CA1区细胞排列相对整齐，细胞结构与正常细胞接近，偶见胞体缩小；2VO+rhEPO+AG490组、2VO+AG490海马CA1区细胞形态学改变与2VO组类似。结论 经鼻腔给予rhEPO能改善血管性痴呆性大鼠的认知功能，其作用机制可能与激活JAK2/STAT3通路有关。

血管性痴呆；促红细胞生成素；JAK2-STAT3；AG490

长期脑灌注不足是临床上常见的病理状态，在老年人中由于部分血管狭窄或闭塞所引起的一种进展、动态变化的过程，随着缺血状态的持续最终导致神经系统变性疾病和血管性痴呆(vascular dementia VD)[1-3]。随着认识的深入发现(EPO)不仅用于促进红细胞的生成，而且是一种具有多种功能的营养因子，EPOR广泛存在脑组织中[4]，体内外实验表明，脑缺血缺氧时，受低氧诱导因子-1(HIF-1)刺激内源性EPO及EPOR表达增加[5]，重组人促红细胞生素(rhEPO)是一种通过基因重组技术合成的，其氨基酸序列及生物学活性与天然EPO完全一致。Witthuhn等[5-6]研究表明，rhEPO在体外可以诱导酪氨酸激酶JAK2磷酸化，并在急性全脑缺血的新生大鼠模型中激活JAK2。在慢性脑缺血时，前期实验表明[7]，rhEPO可以减少神经元凋亡发挥神经元保护作用，推测其机制可能与激活JAK2/STAT3通路有关，外源性给予JAK2特异性抑制剂AG490可以抑制这一神经保护作用。故本研究通过建立血管性痴呆模型，探讨rhEPO可能的神经保护机制。

1 材料与方法

1.1 试验动物 30只清洁级雄性成年SD大鼠，经Morris水迷宫筛选合格后，根据随机数字表法分为5组：假手术组、2VO组、2VO+rhEPO组、2VO+rhEPO+AG490组、2VO+AG490组，每组6只。血管性痴呆模型的建立参照相关文献造模[4]。

1.2 鼻腔给药 按照文献方法鼻腔给药法[4]。10%水合氯醛将大鼠麻醉，仰卧固定于立体定位仪上，将头部后仰70℃。用聚氯乙烯软管(外径1.0 mm，内径0.5 mm)插入大鼠鼻孔约2 cm，软管外端接1 mL注射器，约半小时内将150 U/125 μL rhEPO缓慢地交替推入大鼠的鼻孔，给药完毕后拔除软管，保持以上姿势 30 min，以免药物流失。

1.3 测试指标 Morris水迷宫学习记忆功能测评。定位航行实验测量大鼠学习能力。空间探索实验测量大鼠保存记忆的能力。 脑组织切片，脑组织HE染色。

2 结 果

2.1 Morris水迷宫行为学检测结果

2.1.1 定位航行实验 逃避潜伏期数值越小提示大鼠学习能力越强。造模前5组大鼠平均逃避潜伏期差异无统计学意义(P>0.05)，造模后假手术组与其余4组差异均有统计学意义(P<0.05)，而余4组差异无统计学意义，提示造模成功。用药结束后2VO+rhEPO组逃避潜伏期明显低于2VO组、2VO+rhEPO+AG490组、2VO+AG490组，且差异均有统计学意义(P<0.05)；2VO+rhEPO组、2VO+rhEPO+AG490组差异有统计学意义(P<0.05)，2VO+rhEPO组与假手术组相比平均逃避潜伏期差异无统计学意义。详见表1。

表1 5组大鼠逃避潜伏期组间多重比较

2.1.2 空间探索实验 该实验撤除平台后，以大鼠穿越原平台位置的次数判断记忆能力，穿越次数越多记忆能力越好。2VO+rhEPO组穿越平台次数明显多于2VO组、2VO+rhEPO+AG490组、2VO+AG490组，

且差异均有统计学意义(P<0.05)，2VO+rhEPO组、2VO+rhEPO+AG490组穿越平台次数差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 5组大鼠的空间探索实验结果(±s)

2.3 病理形态学检查结果光学显微镜观察HE病理切片细胞形态学变化，假手术组：海马CA1区神经元呈圆形、椭圆形，排列基本整齐，细胞数量较多，核浆比值大，核仁明显；2VO+rhEPO组：海马CA1区细胞排列尚整齐，胞体形态大多呈圆形、椭圆形，细胞数量较多，偶见少量细胞胞体变小，胞质深染，核固缩，核深染，核溶解；2VO组：海马CA1区细胞排列稀疏、紊乱，神经元细胞较正常组较少，胞体明显缩小，部分胞核固缩，核深染，核仁消失；2VO+rhEPO+AG490组：海马CA1区的细胞排列紊乱，可见部分胞体变小，胞核固缩，核仁消失，胞浆稀疏；2VO+AG490组：海马CA1区的细胞稀疏，排列紊乱，胞体变小，胞核固缩，可见核仁消失，胞浆深染，细胞改变与2VO组相似。

3 讨 论

3.1 rhEPO在脑血管病中的研究现状 rhEPO对急性脑缺血有神经保护作用，而关于rhEPO在长期脑缺血中的作用研究尚少。周彦慧等[7]研究表明，rhEPO对长期脑缺血大鼠中具有神经保护作用，但其具体作用机制尚不清楚。推测鼻腔给予rhEPO诱导STAT3的激活，伴随着相关抗凋亡因子bcl-2、bcl-xl表达的上调和凋亡细胞的减少，AG490通过抑制rhEPO诱导的STAT3激活上游因子JAK活化，伴随着bcl-2、bcl-xl表达的下调和Caspase-3，Bax表达的上调最终起到促凋亡作用。本实验意在证实rhEPO是长期脑灌注不足大鼠神经保护可能的机制之一，并采用JAK/STAT通路特异性抑制剂AG490进行干预，观察rhEPO改善长期脑灌注不足大鼠认知功能是否与激活JAK/STAT通路有关。

3.2 海马神经元的结构变化 海马直接参与信息的贮存和处理，海马神经元的存活数量能直接反映海马对信息的处理、加工和储存能力[8]。各种研究发现血管性痴呆大鼠海马CA1区神经元存在不同程度的凋亡现象，提示海马神经元的丢失可能是血管性痴呆发生的病理基础[9]。本次实验HE病理切片染色示：2VO+rhEPO组海马CA1区神经细胞排列相对整齐，形态接近正常，细胞数量较多，2VO组海马CA1区细胞排列疏松、紊乱，细胞数量较少，可见部分胞体萎缩，核深染，核固缩，核深染；2VO+rhEPO+AG490组、2VO+AG490组海马CA1区细胞形态与2VO组相近；说明鼻腔给予rhEPO能改善长期脑灌注不足大鼠的细胞形态学变化，可能与激活JAK2/STAT3通路发挥神经保护作用有关，且其作用可以被AG490抑制。

3.3 认知功能判断的实验选择 Morris水迷宫实验是经典的检测动物行为学实验之一，2014年诺贝尔生理学或医学奖发现了人脑中的“内置GPS( global positioning system)”定位系统，即大脑海马区中存在一类锥体神经元即位置细胞(Place ceU)。当动物行走到某个特定位置时，相对应的一些特定Place cell激活，当行走到另一位置时，又有相应的其他Place cell激活，这使大脑能够将特定的信息与相应空间位置联系起来，即形成了空间位置记忆。在大脑的内嗅皮质存在另一关键组成细胞即网格细胞(Grid cell) ，正是Grid cell将空间位置进行相应的坐标标记，才实现动物的精确定位及路径寻找，实现内置GPS的功能[10]。因此，更加肯定了本实验采用Morris水迷宫行为学检测大鼠的认知功能。在此实验中，定位航行实验结果提示鼻腔给予rhEPO可改善血管性痴呆大鼠的学习能力，其效果可以被阻断剂AG490阻断。空间探索实验结果提示鼻腔给予rhEPO可能改善长期脑灌注不足大鼠的记忆能力，其效果可以被阻断剂AG490抑制。

本研究结果证实，rhEPO可以改善长期脑灌注不足大鼠认知功能，其机制可能是通过激活JAK/STAT信号转导途径减少神经元的凋亡来实现的，后期需要探讨rhEPO给药剂量及脑缺血不同时间点研究JAK2/STAT3通路的激活情况。

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(本文编辑 王雅洁)

The Possible Mechanism of Recombinant Human Erythropoietin Improving the Cognitive Function in Rats with Vascular Dementia

Yang Qingjie，Guo Junhong The First Hospital，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，Shanxi，China

Corresponding Author：Guo Junhong

Objective To investigate the possible mechanism of recombinant human erythropoietin (rhEPO) to improve the cognitive function in rats with vascular dementia.Methods By Morris water maze qualified after screening，thiry clean male Sprague-Dawley(SD)rats were randomly divided into five groups：Sham group， group 2(2VO group)， group 3(2VO+rhEPO group)，group 42VO+rhEPO+AG490(Janus kinase 2 inhibitor)group and group 5(2VO+AG490 group).Six rats were in each group.The bilateral occlusion of common carotid arteries in SD rats was adopted to established the vascular dementia model.Rats respectively were disposed by intraperitoneal injection of AG490(5 mg/kg) or the same quantity of DMSO-AG490 solvent after chronic ischemia for 3 days.After 30 minutes，rats respectively undergone intranasal delivery rhEPO at the dose of 150 U/125 μL or equivalent volume of saline at the sametime and administered once a week for a total of eight times.After the 8 weeks ， the Morris water maze was explored to observed the spatial learning and memory capability.Morphology changes of hippocampal CA1 nerve cells were observed by Hematoxylin-Eosin (HE) staining.Results Behavioral tests results showed that the mean escape latency， with the increase of training days，was significantly shortened in rats.The average escape latency period in group 3 was lower than that in group 2，group 4 and group 5(P<0.05).The number of cross -platform in group 3 was obviously higher than that in group 2，group 4，group 5(P<0.05).HE staining showed that cells were ordered in the hippocampal CA1 area and with normal cells form in Sham group.The cells of hippocampal CA1 area were disordered and the cell body contraction， nuclear hyperchromatic， nucleus pycnosis and nuclear dissolved could be visible in group2.The cells of hippocampal CA1 area arranged neatly and the cell structure closed to normal cells，a few of contractible cells could be seen occasionally in group 3.The morphological changes of hippocampal CA1 area in group 4 and group 5 were similar to group2.Conclusion The rhEPO could improve the cognitive function in rats with vascular dementia，its mechanism may be related to activation of JAK2-STAT3 pathway.

AG490；vascular dementia；erythropoietin；JAK2-STAT3

山西省科技厅科技攻关项目(No.2013011057-2)

1.山西医科大学第一医院硕士研究生(太原 030001)；2.山西医科大学第一医院

郭军红，E-mail： neuroguo@163.com

R256

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.17.008

1672-1349(2015)17-1940-04

2015-04-23)