莲子心中酚性与非酚性生物碱体外抗氧化活性比较

杨小青，宋金春，谢顺岚，郝好华

(1.武汉大学人民医院药学部，武汉 430060；2.武汉大学药学院，武汉 430072)

莲子心中酚性与非酚性生物碱体外抗氧化活性比较

杨小青1，宋金春1，谢顺岚2，郝好华1

(1.武汉大学人民医院药学部，武汉 430060；2.武汉大学药学院，武汉 430072)

目的比较莲子心中酚性生物碱与非酚性生物碱的体外抗氧化活性。方法采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)-二铵盐(ABTS)、羟基自由基清除、超氧阴离子自氧化，还原力及β-胡萝卜素漂白测试等方法评估莲子心中生物碱的抗氧化活性。结果总生物碱、酚性生物碱、非酚性生物碱对DPPH自由基的半数清除浓度(IC50)分别为21.89，27.10，32.87 μg·mL-1；对ABTS自由基的IC50分别为14.25，20.55，25.94 μg·mL-1；对羟基自由基清除IC50分别为0.03，0.03，0.08 μg·mL-1；超氧阴离子自氧化速率分别为8.72×10-4，5.87×10-4，6.68×10-4；还原力大小：总生物碱>酚性生物碱>非酚性生物碱；脂质抑制率分别为89.63%，85.85%，83.78%。结论莲子心中酚性生物碱对自由基的清除活性、还原力、抗脂质过氧化活性强于非酚性生物碱，具有广阔的应用前景。

莲子心；酚性生物碱；非酚性生物碱；抗氧化活性；体外

在环境、年龄、心理、生理疲劳等多种因素共同作用下，体内的活性氧会产生一系列的病理作用，例如引起DNA损伤、致癌、细胞功能衰退导致机体老化等[1]。越来越多的研究者致力于寻找天然抗氧化剂，以弥补化学抗氧化剂自身的缺陷。生物碱是莲子心中主要的活性成分，其中酚性生物碱主要为双苄基异喹啉类生物碱，此类生物碱结构类型多样，具有广泛的药理活性。有研究者以生物碱母核的差异以及化合物自身的极性差异(有无酚羟基)区别莲子心中酚性和非酚性生物碱[2]。目前对于莲子心的抗氧化作用主要集中在莲子心的粗提物上，较少关注酚性生物碱的抗氧化活性，非酚性生物碱则几乎被忽视。本研究旨在针对莲子心中酚性生物碱(phenolic alkaloids，PA)和非酚性生物碱(nonphenolic alkaloids，NPA)，多指标评价两者的体外抗氧化活性，以期为进一步研究莲子心中总生物碱(total alkaloids，TA)的抗氧化性能提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要化学试剂 莲心碱高氯酸盐对照品(批号：20140319，含量>98.0%)购于中国食品药品检定研究院；丁羟甲苯(butylated hydoxytoluene，BHT，CAS-NO：128-37-0，含量>99.0%)，硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA，CAS-NO：504-17-6)，2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)-二铵盐[2，2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diamm- onium salt，ABTS，CAS-NO：30931-67-0]，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(1，1’-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH，CAS-NO：1898-66-4)，β-胡萝卜素(CAS-NO：7235-40-7)，购于Sigma公司；30%过氧化氢(批号：20131101)，铁氰化钾(potassium ferricyanide，K3[Fe(CN)6]，批号：20121213)，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris-HCl，批号：20130710)，氯化亚铁(批号：20130205)，焦性没食子酸(批号：20131018)，三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA，批号：20131012)，2-脱氧核糖(2-deoxyribose，批号：20130814)，抗坏血酸(批号：20130121，含量：99.7%)，乙二胺四乙酸二钠(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na，批号：20121112)，亚油酸(批号：20130406)，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS，批号：20140607)购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 植物材料 莲子心，购于湖北天济中药饮片有限公司，产地为湖北洪湖，批号：20140101，经武汉大学人民医院药学部张洪教授鉴定为睡莲科莲(NelumbonuciferaGaertn.)成熟种子的绿色胚芽。

1.3 主要实验仪器 SK5200H型超声波清洗器(郑州长城科工贸有限公司)，UV-1800型紫外-可见分光光度计(日本岛津)，RE52CS型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，HHS型精密恒温水浴锅(江苏金坛市医疗仪器厂)，XW-80A型漩涡混合器(上海科导超声仪器有限公司)，YXJ-1型高速离心机(深圳天南海北实业有限公司)。

1.4 莲子心中TA的制备 莲子心磨成粗粉(100 g)，置1 000 mL烧杯中加入75%乙醇(固液比1：3)，封口超声提取3次，每次1 h，过滤之后合并滤液，旋转蒸发回收乙醇，浸膏溶液加1%盐酸调至pH值1～2，滤过，滤液用1%氨水调至pH值9～10，用等体积的三氯甲烷萃取两次，分液合并三氯甲烷层，用无水硫酸钠脱水，滤过，减压旋转蒸发回收三氯甲烷得浸膏，用1%盐酸溶解后转移到烧杯中，1%氨水调至pH值9～10析出沉淀，加水至300 mL静置，用砂芯漏斗过滤得沉淀，冷冻干燥得TA[3]。

1.5 莲子心中PA的制备 将上述莲心总碱取粉末用适量三氯甲烷溶解，再用等体积3%氢氧化钠萃取两次，合并氢氧化钠层，用稀盐酸沉淀，直至上清液滴稀盐酸或稀氨水无沉淀析出。沉淀用砂芯漏斗滤过，冷冻干燥，即得酚性生物碱[4]。

1.6 莲子心中NPA的制备 将“1.5”项下中三氯甲烷层合并，旋蒸回收三氯甲烷，得到浸膏，将浸膏用pH值1～2的盐酸溶液溶解，滴入氨水，出现浅黄色沉淀，至沉淀不再增加，过滤弃其滤液，沉淀干燥，即为非酚性生物碱[5]。

1.7 莲子心中TA、PA和NPA含量测定 取莲心碱高氯酸盐对照品5 mg，精密称定，无水乙醇溶解并定容至25 mL，得浓度为200 μg·mL-1莲心碱高氯酸盐对照品标准液。分别从上述标准溶液中精密吸取1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mL置于7支10 mL量瓶中，无水乙醇稀释至刻度，震荡摇匀。静置10 min后，于282 nm处测量吸光度，以吸光度(A)为纵坐标，浓度C(μg·mL-1)为横坐标绘制标准曲线。准确称取上述TA，PA，NPA干燥粉末各10 mg，无水乙醇溶解，并定容至250 mL。重复上述步骤，于282 nm处测定吸光度，每组样品平行测3组[6]。

1.8 PA和NPA体外抗氧化活性比较

1.8.1 DPPH自由基清除测试 一定浓度范围(2.70～48.65 μg·mL-1，无水乙醇溶解)的莲子心TA，PA，NPA各取0.3 mL分别加入2.7 mL，0.2 mmol·L-1的DPPH(用无水乙醇溶解)，涡旋混匀，将配好的样品避光静置1 h后在517 nm处测其吸光度。以1 mL无水乙醇代替提取物作为空白对照，同样浓度范围的BHT作为阳性对照。DPPH清除率(%)=[(AⅠ-As)/AⅠ]×100%，其中，AⅠ表示空白对照DPPH的吸光度，As表示待测样品DPPH吸光度[7]。

1.8.2 ABTS自由基清除试验 7 mmol·L-1ABTS与2.45 mmol·L-1过硫酸钾以9：1比例混合室温下静置16 h，使用前稀释八倍作为ABTS储备液。一系列浓度范围(1.43～25.70 μg·mL-1，无水乙醇溶解)的莲子心TA，PA，NPA(1.0 mL)中分别加入2.5 mLABTS储备液，混匀后避光反应20 min并于波长734 nm处测定吸光值。以1 mL双蒸水加ABTS待用混合液作为空白对照，BHT作为阳性对照。ABTS清除率(%)=[(AⅠ-As)/AⅠ]×100%，其中，AⅠ表示空白对照ABTS的吸光度，As表示待测样品ABTS吸光度[8]。

1.8.3 羟基自由基清除 反应体系中分别加入10 mmol·L-1的2-脱氧核糖400 μL、氯化铁(10 mmol·L-1)100 μL、EDTA-2Na(1 mmol·L-1)100 μL、30%过氧化氢(10 mmol·L-1)100 μL、3种生物碱(10～100 μg·mL-1) 100 μL，再加入抗坏血酸(1 mmol·L-1)200 μL引发反应，在37 ℃下反应1 h，加入0.5%TBA的氢氧化钠(0.025 mol·L-1)溶液1 mL和30%TCA水溶液1 mL，混合物80 ℃水浴加热30 min，冷却。在532 nm处测定吸光值As，以0.05 mol·L-1PBS(pH值7.4)在反应体系中代替样品作为空白对照测得吸光值AⅠ，计算清除率，同浓度范围的BHT作为阳性对照。羟基清除率(%)=[(AⅠ-As)/AⅠ]×100%，其中，AⅠ表示空白对照的吸光度，As表示待测样品吸光度[9]。

1.8.4 超氧阴离子自由基清除 200 μg·mL-1待测样品1 mL加入Tris-HCl缓冲液(pH值8.2，0.05 mol·L-1)4.5 mL在25 ℃下反应10 min加入0.003 mol·L-1邻苯三酚(10 mmol·L-1盐酸溶解)600 μL，充分反应后立即在波长325 nm处测定吸光度，每隔30 s测定一次吸光度，直至吸光值不再发生明显变化，用10 mmol·L-1盐酸代替样品作为空白对照，BHT作阳性对照。邻苯三酚的自氧化速率可以根据吸光度-时间曲线计算斜率[10]。

1.8.5 还原能力测试 各取TA，PA，NPA20 mg配制成400 μg·mL-1，样品溶液，分别取50，125，200，250，300，350，400，450，500 μL样品，加双蒸水至1 mL，分别加0.2 mol·L-1PBS(pH值=6.6)和1%K3[Fe(CN)6]各2.5 mL，在50 ℃下反应20 min，再加入10%TCA 2.5 mL，3 000 r·min-1(r=3 cm)离心10 min，取上清液2.5 mL加入双蒸水2.5 mL，加入0.1%氯化铁0.5 mL混合，10 min后在700 nm测定吸光值As，以不加样品的双蒸水同法操作作为空白对照测得吸光值，增加的吸光度表示还原能力的增加[11]。

1.8.6 β-胡萝卜素漂白测试 精密称取β-胡萝卜素6 mg溶解于三氯甲烷20 mL中，取上述β-胡萝卜素溶液4 mL，亚油酸80 mg、聚山梨酯80 800 mg混合于500 mL的圆底烧瓶中，旋转蒸发除去三氯甲烷，后加入双蒸水200 mL，旋转得乳化液。取上述乳化液3.0 mL分别加入到含有0.2 mL，500 mg·mL-1的TA，PA，NPA的试管中，50 ℃热水浴下孵育2 h。在470 nm处检测吸光度值，每隔30 min检测一次，测2 h。BHT作为阳性对照[12]。脂质抑制率(%)=[(AⅠ-As)/AⅠ]×100%，其中AⅠ表示0 min时的吸光度，As表示孵育2 h时的吸光度。

2 结果

2.1 样品中PA和NPA的含量 采用紫外分光光度法检测莲子心中TA、PA、NPA含量，莲心碱高氯酸盐对照品在20～80 μg·mL-1范围内具有良好的线性范围，标准曲线为A=0.013 9C-0.033 9，(R2=0.999 9)。测得每100 g莲子心粗粉中可制得TA 0.91 g，每100 g TA中可分离得到PA 87 g，NPA 11 g。

2.2 体外抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基的清除作用 BHT、TA、PA和NPA在2.70～48.65 μg·mL-1浓度范围内对DPPH自由基具有较强的清除作用，且呈剂量依赖性，见图1A，IC50值见表1。

2.2.2 ABTS自由基清除作用 在1.43～25.70 μg·mL-1范围内，BHT，TA，PA和NPA表现出较强的ABTS自由基清除作用，见图1B，IC50值见表1。

2.2.3 羟基自由基清除 BHT，TA，PA和NPA在0.07～0.33 μg·mL-1范围内对羟基自由基的清除作用见图1C，IC50值见表1。

2.2.4 超氧阴离子清除作用 200 μg·mL-1BHT，TA，PA和NPA对超氧阴离子自氧化的抑制作用见图2，4种药物作用于邻苯三酚体系其自氧化速率见表1。

A.DPPH自由基；B.ABTS自由基；C.羟基自由基

表1 BHT、TA、PA、NPA对自由基半数清除浓度(IC50)

Tab.1 IC50values of BHT，TA，PA，NPA on free radicals

药物IC50/(μg·mL-1)DPPHABTS·OHβ⁃胡萝卜素脂质抑制率/%超氧阴离子Kb(×10-4)BHT8．853．910．0144．379．19TA21．8914．250．0389．638．72PA27．1020．550．0385．855．87NPA32．8725．940．0883．786．68

图2 BHT、TA、PA、NPA对超氧阴离子清除作用(n=3)

Fig.2 Clearance of BHT, TA, PA, and NPA on superoxide anion radicals(n=3)

2.2.5 总还原力测定 BHT、TA、PA和NPA还原性测定见图3，4种样品还原力均随浓度升高而增加。

图3 BHT、TA、PA、NPA总还原力测定(n=3)

Fig.3 Detection on reducing power of BHT, TA, PA, and NPA(n=3)

2.2.6 β-胡萝卜素漂白测试 β-胡萝卜素漂白测试的结果见图4，4种样品对脂质过氧化的抑制率见表1。

3 讨论

DPPH和ABTS是两种相对稳定的自由基化合物，最常用于抗氧化活性评价。在DPPH自由基清除实验及ABTS自由基清除活性中，根据图1A，1B 结果均可明显发现莲子心中生物碱(TA，PA，NPA)对DPPH和ABTS自由基的清除具有剂量依赖性，且随样品浓度增大，抑制率增加。

图4 BHT、TA、PA、NPA对β-胡萝卜素漂白测试影响(n=3)

Fig.4 β-carotenoid bleaching assay of BHT, TA, PA, and NPA(n=3)

本研究采用Fe3+-EDTA-抗坏血酸-过氧化氢体系产生羟基自由基，脱氧核糖受羟基自由基进攻后裂解，在酸性、加热的条件下与硫代巴比妥酸反应生成红色化合物，抗氧化剂的存在可阻止羟基自由基攻击脱氧核糖[13]。根据图1C和表1结果，非酚性生物碱对羟基自由基的抑制率最弱，总生物碱与酚性生物碱相近并稍弱于BHT。

超氧阴离子是体内最常见的自由基之一。焦性没食子酸在碱性环境中自发产生超氧阴离子，其自氧化的速率与超氧阴离子的浓度相关。待测物可清除超氧阴离子能力而减缓焦性没食子酸自氧化的速率。根据表1中Kb值，对于抑制焦性没食子酸自氧化的速率依次为BHT>TA>NPA>PA。

本研究采用铁还原抗氧化能力法测定生物碱的总还原能力，在酸性环境下，Fe3+-三吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)可被抗氧化剂还原为二价铁形式，呈现出蓝色，并于593 nm 处有最大吸收，吸光度越大，还原能力越强[14]。莲子心中生物碱由于其本身强的还原性与Fe3+竞争，抑制Fe3+被氧化，从图3中可看出在相同浓度下，TA还原性最强，其次为PA，最弱为NPA，且均弱于BHT，此结果与对自由基抑制率活性一致。

脂质过氧化是另一类对生命有机体产生重大影响的氧化作用。不饱和脂肪酸的脂质过氧化损伤将影响细胞膜的流动性，可导致多种疾病及机体衰老。本研究采用β-胡萝卜素漂白模型对生物碱的抗脂质过氧化比较。结果表明，莲子心中生物碱对β-胡萝卜素-亚油酸脂质过氧化体系有良好的抑制作用，在相同剂量下，生物碱的抑制作用均强于对照BHT，抑制效果最佳为TA，PA和NPA差距不大。

综上所述，莲子心生物碱中酚性生物碱的抗氧化活性强于非酚性生物碱。从而表明莲子心酚性生物碱在体外抗氧化活性研究中具有一定的开发潜力。

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《医药导报》编辑部

Comparison of Antioxidant Activity Between Phenolic and Nonphenolic Alkaloids in Nelumbo Nucifera Gaertn in vitro

YANG Xiaoqing1, SONG Jinchun1, XIE Shunlan2, HAO Haohua1

(1.DepartmentofPharmacy,RenmingHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China； 2.PharmaceuticalCollege,WuhanUniversity,Wuhan430072,China)

Objective To compare the antioxidant activity between phenolic and nonphenolic alkaloids inNelumboNuciferaGaertn.invitro. Methods DPPH, ABTS, hydroxyl radical scavenging, super oxygen anion from oxidation, reducing power and beta carotene bleaching test methods were used to evaluate the antioxidant activity of the alkaloids. Results Half maximalinhibitory concentration (IC50) of DPPH among total alkaloid, phenolic alkaloids and nonphenolic alkaloids was 21.89, 27.10 and 32.87 μg·mL-1, respectively； IC50of ABTS free radicals was 14.25, 20.55, 25.94 μg·mL-1； The hydroxyl radical scavenging IC50was 0.03, 0.03, 0.08 μg·mL-1； The auto-oxidation rate of super oxygen was 8.72×10-4, 5.87×10-4, 6.68×10-4； The total alkaloid had the best reducing power, while the non-phennolic alakloids had the worst； Lipid inhibition rate of three alkaloids were 89.63%, 85.85% and 83.78% respectively. Conclusion Phenolic alkaloids are better than non-phenolic alkaloids in hydroxyl radical scavenging, reducing power and anti-lipid peroxidation, resulting in a promising prospect.

NelumbonuciferaGaertn.； Phenolic alkaloids； Nonphenolic alkaloids； Antioxidant activity；invitro

2014-12-01

2015-03-06

杨小青(1990-)，女，湖北宜昌人，在读硕士，研究方向：临床药学。电话：(0)15271919075，E-mail：yangxiaoqing9075@163.com。

宋金春(1964-)，男，湖北孝感人，教授，主任药师，博士，研究方向：临床药学。电话：027-88047471，E-mail：songjc1234@126.com。

R285.5

A

1004-0781(2015)12-1579-05

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.12.008