丁苯酞氯化钠注射液对急性缺血性脑卒中患者内皮祖细胞的影响

2015-01-05胡杰杰薛茜邹玉安

医药导报 2015年12期

关键词：丁苯氯化钠外周血

胡杰杰，薛茜，邹玉安

(1.河北北方学院，张家口 075000；2.河北北方学院附属第一医院神经内科，张家口 075000)

丁苯酞氯化钠注射液对急性缺血性脑卒中患者内皮祖细胞的影响

胡杰杰1，薛茜2，邹玉安2

(1.河北北方学院，张家口 075000；2.河北北方学院附属第一医院神经内科，张家口 075000)

目的观察丁苯酞氯化钠注射液对急性缺血性脑卒中(AIS)患者外周循环内皮祖细胞(EPCs)水平的影响，通过分析EPCs水平与血浆基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)浓度的相关性，探讨丁苯酞氯化钠注射液可能的作用机制。方法选取AIS患者59例，随机分为治疗组与对照组，丁苯酞氯化钠注射液治疗14 d为1个疗程。入院后第1，8，15天清晨抽取患者肘静脉血，流式细胞仪检测外周血EPCs含量，CD34+CDl33+KDR(CD309)+确认为内皮祖细胞，酶联免疫吸附测定法检测患者血浆SDF-1α浓度，同时于上述时间点对患者进行美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分。结果治疗组患者与对照组患者外周血EPCs水平14 d内均逐渐升高，EPCs水平基线期两组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，治疗组第8，15天EPCs水平与同期对照组比较，均差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。SDF-1α浓度变化与EPCs水平变化相似。两组患者NIHSS评分14 d内均逐渐降低，基线期NIHSS评分两组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，治疗组第8，15天NIHSS评分均较同时间点对照组明显降低(P<0.05或P<0.01)。Pearson相关分析显示治疗组第8，15天血浆SDF-1α浓度与外周血EPCs水平高度相关(r=0.747，P<0.01；r=0.811，P<0.01)。两组患者用药期间均无不良事件发生。结论丁苯酞氯化钠注射液可以有效改善AIS患者急性期内神经功能缺损，其机制可能为通过上调SDF-1α的表达，促进EPCs动员，改善缺血部位血液循环。

丁苯酞氯化钠注射液；脑卒中，缺血性，急性；内皮祖细胞；基质细胞衍生因子-1α

丁苯酞氯化钠注射液是我国研发的国家一类新药，它通过保护线粒体功能、清除氧自由基、抑制血小板聚集、改善缺血部位血液循环等作用，显示出良好的抗脑缺血能力。以往研究显示丁苯酞能够安全有效提高急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke，AIS)患者美国国立卫生研究院卒中量表(national institute of health stroke scale，NIHSS)评分，改善患者神经功能缺损[1-2]。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管内皮的前体细胞，具有分化为成熟内皮细胞促进血管内皮修复的能力。脑梗死动物模型已证实，骨髓来源的EPCs参与了梗死部位周边新血管的形成[3]。基质细胞衍生因子-1α(stromal cell derived factor-1α，SDF-1α)通过SDF-1/C-X-C家族趋化因子受体-4(C-X-C chemokine receptor- 4，CXCR-4)轴的作用在EPCs动员过程中发挥重要作用[4]。研究表明，外周血EPCs水平在缺血性卒中后7 d内逐渐增加，血浆SDF-1α浓度在卒中后7 d也是增加的，二者正相关[5]。目前有关丁苯酞氯化钠注射液改善缺血脑组织血液循环机制的报道较少，本研究以AIS患者急性期丁苯酞氯化钠注射液治疗为立足点，从卒中后早期血管生成、恢复血流灌注的角度出发，通过测定AIS患者急性期不同时间点外周血EPCs水平及血浆SDF-1α浓度，分析两者相关性，旨在阐明丁苯酞氯化钠注射液在AIS治疗中的作用机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 AIS诊断标准：安静状态下或活动中发病；大多数发病时无明显头痛和呕吐；有颈内动脉系统症状和体征；头颅磁共振检查(弥散加权成像)显示与症状和体征相匹配的新发梗死病灶。入选标准：缺血性脑卒中患者为首次发生的颈内动脉系统的非腔隙性脑卒中，在症状出现72 h内入组，均为头颅磁共振检查所证实，NIHSS评分≥5分。脑卒中的诊断标准均符合全国第四届脑血管病学术会议修订的缺血性脑卒中诊断标准[6]。排除标准：颅内出血性疾病；急性炎症性疾病；严重的肝肾疾病；血液性疾病；慢性消耗性疾病或恶性肿瘤；精神疾病；重度意识障碍或既往脑卒中病史；6个月内有丁苯酞软胶囊或丁苯酞氯化钠注射液使用史；6个月内有心肌梗死或其他动脉梗死病史；6个月内有外伤、手术史；6个月内有他汀类、氯吡格雷、促红细胞生成素等药物服用史；对芹菜过敏。严格参照上述标准选取2013年6月—2014年6月入河北北方学院附属第一医院神经内科治疗的AIS患者63例，其中男33例，女30例，按入院先后顺序编码，奇数号患者入选治疗组，偶数号患者入选对照组，其中对照组患者因发现恶性肿瘤剔除1例，并发急性胆囊炎(丁苯酞氯化钠注射液治疗尚未开始)剔除1例，未完成血样采集脱落1例，治疗组未完成血样采集脱落1例。最终进入该研究对照组的患者为29例，男19例，女10例，治疗组患者30例，男21例，女9例。两组患者年龄、性别、血压、血脂、血糖等一般临床资料相匹配，差异无统计学意义(均P>0.05)。见表1。该研究通过河北北方学院附属第一医院伦理委员会审查，所有受试者入组前均签署自愿参加该项研究的知情同意书。

1.2 治疗方法治疗组给予丁苯酞氯化钠注射液(石药集团恩必普药业有限公司，批准文号：国药准字H20100041，规格：100 mL：丁苯酞25 mg与氯化钠0.9 g) 25 mg·(100 mL)-1静脉滴注，bid。对照组给予氯化钠注射液(石药集团恩必普药业有限公司，规格：100 mL，外观包装、批号与丁苯酞氯化钠注射液完全一致)100 mL静脉滴注，bid，疗程均为14 d。丁苯酞氯化钠注射液及氯化钠注射液的治疗均在入院后第1天留取静脉血和完成NIHSS评分后开始进行。除此，两组均使用相同的基础用药，主要为：阿司匹林肠溶片(拜耳医药保健有限公司，批准文号：国药准字J20130078，规格：100 mg)100 mg，po，qd，普伐他汀钠片(华北制药股份有限公司，规格：10 mg，批准文号：国药准字H20050736)20 mg，po，qn，依达拉奉注射液(吉林省辉南长龙生化药业股份有限公司，批准文号：国药准字H20080592，规格：20 mL：30 mg)30 mg，静脉滴注，bid。两组患者的治疗均按照《中国急性缺血性脑卒中诊治指南》进行。

1.3 观察指标两组患者入院后第1，8，15天清晨空腹抽取患者肘部外周静脉血用于外周血EPCs检测和血浆SDF-1α浓度检测[人SDF-1α 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)试剂盒，R&D公司进口分装，规格：96T，批号：20131122]，并由经过专业培训的神经病学医师在上述相应时间点对入选患者进行NIHSS评分。EPCs检测：新鲜静脉血2 mL中按1：1加入磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)2 mL，充分混匀，后以1：1比例缓慢加于人淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限公司，规格：200 mL，批号：20130220-1199)4 mL之液面上，保持与分离液界面清晰，400×g，离心25 min，小心留取中间环形絮状单个核细胞层，PBS洗涤两次后，留取单个核细胞，取分离洗涤好的单个核细胞悬液100 μL，加入荧光标记的Anti-CD34/FITC(北京博奥森生物技术有限公司，规格：100 μg，批号：980782)、Anti-CD133/APC(北京博奥森生物技术有限公司，规格：100 μg，批号：20131113)、Anti-KDR(CD309)/PE(BD公司，规格：100T，批号：3109796)各10 μL，震荡混匀，室温避光孵育10 min，PBS洗涤两次，流式细胞仪(BD公司)检测500 000个细胞，3种抗体均为阳性的细胞确认为EPCs，其细胞数作为外周血中EPCs水平；同型抗体做阴性对照。见图1。SDF-1α检测：2 mL新鲜静脉血，3 000 r·min-1(r=8 cm)离心20 min，收集上清用于SDF-1α浓度检测；血浆SDF-1α浓度使用ELISA试剂盒进行检测，操作过程严格按照试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 两组患者NIHSS评分两组基线期(第1天)NIHSS评分差异无统计学意义；第15天，对照组NIHSS评分显著低于基线期(P<0.01)；治疗组NIHSS评分第8，15天均较基线期明显降低，而第15天较第8天又有下降；与对照组比较，治疗组第8，15天NIHSS评分均明显降低。见表2。

2.2 两组患者外周血EPCs水平基线期外周血EPCs水平差异无统计学意义，随后14 d内均逐渐升高。两组组内各时间点方差分析均显示存在统计学差异。治疗组第8，15天EPCs水平较对照组均显著升高，差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。见表2。

A、B、C：第1天；D、E、F：第8天；G、H、I：第15天；CD309：KDR

2.3 两组患者血浆SDF-1α浓度变化与EPCs相似，14 d内均逐渐升高。两组组内各时间点方差分析均显示存在差异统计学意义。治疗组第8，15天血浆SDF-1α浓度较对照组均显著升高，差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。见表2。

2.4 相关性分析对照组第15天血浆SDF-1α浓度与同时间点EPCs水平显著正相关，差异有统计学意义(r=0.518，P<0.01)；治疗组第8，15天，血浆SDF-1α浓度与同时间点EPCs水平高度正相关，差异有统计学意义(分别为r=0.747，P<0.01；r=0.811，P<0.01)。

表1 两组患者一般情况比较

组别例数发病时间/h性别男/例女/例年龄/岁高血压例%糖尿病例%吸烟例%饮酒例%对照组2928．00±21．19191064．07±12．341344．831034．48724．14517．24治疗组3030．03±22．3621961．60±10．131550．001550．001446．67930．00组别高低密度脂蛋白血症例%高同型半胱氨酸血症例%糖化血红蛋白∗1/%治疗前空腹血糖∗1治疗后空腹血糖∗1(mmol·L-1)对照组1344．831241．388．78±2．018．09±2．076．20±0．84治疗组1860．00930．008．31±1．608．28±2．416．06±0．95

*1：糖尿病患者

表2 两组患者NIHSS评分及EPCs水平和SDF-1α浓度的比较

组别与时间例数NHISS评分/分EPCs(个/100万个细胞)SDF⁃1α/(ng·L-1)对照组29 第1天10．07±2．9460．55±20．67879．55±427．23 第8天9．52±2．6873．90±22．64∗11094．36±490．08∗1 第15天8．00±3．05∗1∗290．14±26．71∗1∗21306．71±391．27∗1∗2治疗组30 第1天10．67±2．1961．50±20．73956．86±438．37 第8天8．23±1．92∗1∗388．90±27．65∗1∗31407．30±560．99∗1∗3 第15天6．03±1．75∗1∗2∗5115．37±29．69∗1∗2∗41687．05±585．01∗1∗2∗5

组内比较(重复测量资料的方差分析)，F=25.85，190.57，37.03，58.82，30.61，27.2，均为P<0.01，与基线期第1天相较，*1P<0.01，与第8天相较，*2P<0.01；与对照组相同时间点比较，t=2.12，2.28，2.28，*3P<0.05，t=3.43，*4P<0.01(两独立样本t检验)，z=2.68，2.74，*5P<0.01(两独立样本秩和检验)

2.5 不良反应两组患者用药期间均未出现肝肾功能等指标异常，无再次卒中等不良事件发生。

3 讨论

丁苯酞是由芹菜中提取的消旋-3-正丁基苯酞，通过多靶点作用表现出良好的抗缺血能力[7]。动物实验显示丁苯酞可以增加梗死区域血流量，口服丁苯酞软胶囊的疗效也在临床研究中得以验证[1]。急性期是AIS治疗的关键时期，口服丁苯酞软胶囊生物利用率低，而且胶囊制剂亦不适用于存在吞咽困难的患者，故本研究以丁苯酞氯化钠注射液为治疗干预措施，探讨其改善缺血脑组织血运的机制。研究中通过对两组患者NIHSS评分进行比较，证实丁苯酞氯化钠注射液可以显著改善急性缺血性卒中患者神经功能缺损，与已有临床研究结果相符[2]。

外周血EPCs，是血管系统的重要组成成分，可分化为成熟的内皮细胞，参与血管受损后修复和血管生成。脑内内皮细胞再生极其有限，而EPCs以其修复受损血管的独特优势，在脑梗死后改善缺血组织血液循环中发挥重要作用。动物实验和临床研究均已显示EPCs参与了脑缺血组织新血管形成过程[3-8]。EPCs可以通过它的血管生成能力重塑卒中后受损的血脑屏障，促进脑卒中恢复，并消除大脑和血管的免疫反应[9]。

研究显示，CD34+的EPCs在卒中后7 d内逐渐增加，并保持明显高于卒中前基线水平至第14天，30天回归到基线水平。在本研究中两组患者急性期内EPCs水平均逐渐升高，这与文献[8]结果相吻合。EPCs水平升高更显著的治疗组第15天NIHSS评分也较低，推测EPCs通过参与脑卒中缺血部位血管生成，促进了患者神经功能恢复。SOBRINO等[8]指出，AIS患者外周循环中EPCs的数量反应性增加，而且增加的程度与较好的功能预后直接相关，YIP等[10]研究显示循环中EPCs的水平能够独立的预测缺血性脑卒中患者的预后，而且缺血性卒中急性期患者循环中EPCs水平的增加是卒中后90 d较好临床预后唯一的独立预测因素。遗憾的是本研究由于实际情况限制，未能完成90 d随访，但治疗组急性期EPCs水平较对照组显著升高，根据YIP等[10]的研究推测，丁苯酞氯化钠注射液治疗组患者卒中90 d的神经功能恢复也应较好。

本研究中，根据患者外周血EPCs数量与血浆SDF-1α浓度的相关分析结果推断丁苯酞氯化钠注射液上调了患者SDF-1α的表达，在SDF-1/CXCR-4轴的作用下，EPCs由骨髓向外周循环的动员增加。大多数EPCs静态存在于骨髓微环境中，一些信号可以将其从骨髓中动员出来。SDF-1α是EPCs重要的动员因子，它由骨髓基质细胞表达，是带有CXCR-4特异性受体的CXC家族趋化因子，也是一种强效的造血干细胞化学吸引分子。在动员过程中，SDF-1α与表达于EPCs表面的CXCR-4结合，介导EPCs向缺血部位和动脉损伤部位募集。有报道指出SDF-1α与缺血性卒中患者早期外周循环中EPCs的增加相关[11]。在YU等[12]的研究中将SDF-1α注射到缺血部位，观察到EPCs的募集。

总之，根据本研究结果推断丁苯酞氯化钠注射液可通过提高外周血EPCs水平，改善缺血部位血液循环，促进AIS患者急性期内神经功能改善，其动员机制可能为上调SDF-1α的表达。

本研究由于条件限制，未能对入选者进行追踪随访，对丁苯酞氯化钠注射液远期影响未能进行观察。此外，本研究纳入病例数较少，两组入选患者同时使用依达拉奉和他汀类药物，均可能会对结果产生一定影响。

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2016年《医药导报》各期药物专栏要目

第1期：中药与天然药物专栏；第7期：感染科用药专栏；

第2期：风湿免疫疾病用药专栏；第8期：肿瘤科用药专栏；

第3期：呼吸科用药专栏；第9期：神经内科用药专栏；

第4期：麻醉科用药专栏；第10期：精神心理疾病用药专栏；

第5期：儿科用药专栏；第11期：消化内科用药专栏；

第6期：妇产科计划生育用药专栏；第12期：皮肤性病用药专栏。

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《医药导报》编辑部

2014-11-24

2015-04-20

胡杰杰(1981-)，女，河北衡水人，主治医师，硕士，研究方向：脑血管病。电话：(0)15379043317，E-mail：2590260537@qq.com。