头孢地尼胶囊在健康人体的生物等效性研究

陈芬，朱超然，翟学佳，冯霞，邓桂萍，郭卿，蒋立芬，吕永宁

(1.华中科技大学同济医学院附属协和医院药剂科，武汉 430022；2.石家庄市华新药业有限责任公司，石家庄 050091；3.河北省人民医院体检中心，石家庄 050051)

头孢地尼胶囊在健康人体的生物等效性研究

陈芬1，朱超然1，翟学佳1，冯霞1，邓桂萍1，郭卿2，蒋立芬3，吕永宁1

(1.华中科技大学同济医学院附属协和医院药剂科，武汉 430022；2.石家庄市华新药业有限责任公司，石家庄 050091；3.河北省人民医院体检中心，石家庄 050051)

目的 评价健康人餐后服用两种头孢地尼胶囊的生物等效性。方法 24例男性健康志愿者餐后随机交叉单剂量口服头孢地尼胶囊受试制剂或参比制剂，头孢地尼体内血药浓度采用液相色谱-质谱串联(LC-MS/MS)法测定，药动学参数及等效性采用药动学软件DAS计算和评价。结果 受试制剂和参比制剂的主要药动学参数如下：AUCt分别为(4.35±1.09)和(4.12±1.22) μg·h·mL-1，AUC0-∞分别为(4.53±1.12)和(4.53±1.73)μg·h·mL-1，t1/2分别为(1.74±0.29)和(2.13±1.65) h，tmax分别为(4.44±0.86)和(4.54 土1.16) h，Cmax分别为(900±250)和(876±269) ng·mL-1。结论 头孢地尼胶囊受试制剂与参比制剂具有生物等效性。

头孢地尼胶囊；液相色谱-质谱串联联用；药动学；生物等效性

头孢地尼是第3代头孢菌素类抗菌药物，1988年由日本藤泽药品工业公司合成，1991年在日本上市，1997年被美国食品药品管理局(FDA)批准临床使用[1]。头孢地尼对革兰阴性菌和革兰阳性菌均具有广泛的抗菌谱，其抗菌机制主要是抑制细菌细胞壁合成，并且对各种细菌产生的β-内酰胺酶稳定，因而对可产生β-内酰胺酶的细菌也具有优异的抗菌活性[2]。头孢地尼对革兰阳性菌中的葡萄菌属、链球菌属等的抗菌活性比以往的口服头孢菌素更强[3]。笔者在本试验采用液相色谱-质谱串联联用(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)法测定血浆头孢地尼浓度，研究受试制剂和参比制剂头孢地尼胶囊在健康志愿者体内的餐后药动学和生物等效性，以期为临床用药提供参考。

1 试药与仪器

1.1 试药 受试制剂：头孢地尼胶囊，批号：310130107，规格：每粒0.1 g，石家庄市华新药业有限责任公司；参比制剂：头孢地尼胶囊(商品名：全泽复，批号：023730，规格：每粒0.1 g，日本藤泽药品工业公司)；头孢地尼对照品(批号：30502-201002，中国食品药品检定研究院，含量：95.6%)。头孢克洛对照品(内标)(批号：130481-200503，中国食品药品检验研究院，含量：93.2%)。

1.2 仪器 高效液相色谱仪器：安捷伦1200液相色谱仪，含G1322A在线脱气机、G1311A高压四元泵、G1329A自动进样器、G1316A柱温箱。质谱仪器：API 4000 LC-MS/MS System，配备电喷雾离子化源(ESI)，美国ABI公司。色谱工作站：Analyst 1.5。Shimadzu电子分析天平(AUW220D，日本岛津公司，感量：0.1/0.01 mg)、LEGEND MICRO 21R台式高速离心机(武汉赤诚生物技术有限公司)、 XW-80A微型旋涡混和仪(上海泸西分析仪器厂)。

2 方法与结果

2.1 研究对象 24例受试者均为男性，年龄(22.13±1.48)岁，身高 (173.58±5.42) cm，体质量(65.04±6.52)kg，体重指数为(21.56±1.51) kg·(m2)-1，试验前血常规、尿常规、肝功能、肾功能、乙型肝炎、丙型肝炎、人类免疫缺陷病毒抗体检测、心电图检查等均正常，无心、肝、肾、代谢异常等病史，无慢性胃肠道疾病，无药物过敏史及药物依赖史，无精神病史，不嗜烟酒，试验前2周内及试验期间均未服用任何药物。本试验方案通过华中科技大学同济医学院医学伦理委员会审查。试验前受试者在了解本项研究的目的、意义、步骤、利益和可能发生的损害后签署知情同意书。

2.2 给药方案与血样采集 本试验采用双周期自身交叉对照试验设计。24例受试者随机分为两组，每组每次试验餐后单次口服受试制剂或参比制剂，两次试验间的清洗期为7 d。受试者于前1天入住，晚上统一清淡饮食，禁食10 h、不禁水过夜。次日早晨吃标准早餐。早餐包括馒头约100 g、稀饭约150 mL及用菜籽油约20 mL烹饪的猪肉75 g(肥瘦比为2：1)，煎蛋1枚和蔬菜100 g。吃完早餐半小时后，饮水200 mL服受试制剂或参比制剂1粒。服药后2 h方再饮水，4 h内不得躺下，以免影响胃肠蠕动，4和10 h统一进餐，并按试验方案在服药前后不同时间采取血样，密切观察。受试者在试验当日不得离开监护室内，禁止剧烈运动、吸烟、饮酒等。

采血时间点为服药前(0 h)和服药后1，2，3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，7，8，10，12 h。每次经肘静脉取血4 mL置于含乙二胺四醋酸(EDTA)的抗凝管中，血样30 min内900×g离心10 min，分离血浆，置-80 ℃冰箱备用。

2.3 方法学考察与评价

2.3.1 色谱条件 色谱柱：Waters Atlantis®d C18色谱柱 (2.1 mm×150 mm，5 μm)；预柱：C18保护柱(4 mm×3.0 mm，美国Phenomenex公司)；流动相：甲醇-0.3%甲酸水溶液=(38：62)；流速：0.3 mL·min-1；进样量：10 μL；柱温：40 ℃；进样器温度：4 ℃。

2.3.2 质谱条件 离子检测方式：选择性离子检测(MRM)；离子极性：正离子；离子化方式：气动辅助电喷雾离子化(ESI)；检测对象：头孢地尼，[M+H]+离子对m/z396.1→227.1，头孢克洛，[M+H]+离子对m/z368.0→174.2；DP电压：头孢地尼为60.00 V，头孢克洛为69.00 V；CE电压：头孢地尼为19.00 V，头孢克洛为18.00 V；EP电压：头孢地尼为10.00 V，头孢克洛为10.00 V；CXP电压：头孢地尼为12.00 V，头孢克洛为4.00 V；IS：5 500 V；CUR：172.375 kPa；CAD：41.370 kPa；温度：550 ℃；GAS1：344.750 kPa；GAS2：344.750 kPa。

2.3.3 血浆样品处理 精密吸取血浆200 μL至1.5 mLEP管中，加入10 mmol·L-1乙酸铵水溶液20 μL，加入内标溶液(5 280 ng·mL-1)20 μL，涡旋20 s，再加入甲醇500 μL，涡旋1 min，14 800 r·min-1离心15 min(有效离心半径8.5 cm)，取上清液200 μL于另一1.5 mL EP管中，用等量10 mmol·L-1乙酸铵水溶液稀释，涡旋20 s后，14 800 r·min-1离心5 min，取上清液200 μL于进样瓶中，进样10 μL进行分析，并记录色谱图。

2.3.4 特异性 本试验在上述色谱条件下，头孢地尼及内标的保留时间分别为2.6和2.8 min。头孢地尼和内标峰形良好，与空白血浆样品的色谱图进行比较，出峰位置无杂峰干扰测定(图1～3)，说明本方法具有较高的特异性，能准确测定血浆头孢地尼浓度。

2.3.5 标准曲线与定量下限 精密吸取空白血浆200 μL，加各系列的标准溶液20 μL，配制成浓度分别为10.14，50.7，126.75，253.5，430.95，887.25，1 267.5 ng·mL-1的头孢地尼血浆样品，按“血浆样品处理”项下，自“加入内标工作液20 μL”起同法操作，记录色谱图；以待测物浓度(C)为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值(f)为纵坐标，用加权(W=1/x2)最小二乘法进行回归运算，得到标准曲线方程为Y=0.004 84X+0.029 6(r=0.999 2)。根据标准曲线方程，本分析方法下头孢地尼的线性范围应为10.14～1 267.5 ng·mL-1。

2.3.6 残留效应 在测定定量上限(ULOQ)样本之后测定1个空白血浆样本和1个定量下限(LLOQ)样本。上述测定流程重复3次。残留效应因子为上述空白血浆样本中分析物和内标的峰面积除以定量下限样本中分析物和内标的峰面积(3个样本平均峰面积)。头孢地尼和内标的残留效应因子分别为10.7%和0%。结果表明，内标无残留效应，头孢地尼残留效应在可接受范围内。

2.3.7 基质效应 精密吸取空白血浆样品200 μL，共计12份，置于1.5 mL EP管中，加入10 mmol·L-1乙酸铵溶液20 μL，加甲醇500 μL，涡旋1 min，于14 800r·min-1离心15 min，分别吸取各管全部上清液作为基质，加入内标溶液20 μL，每6份分别加入低浓度(30 ng·mL-1)和高浓度(1 000 ng·mL-1)的2个浓度的QC溶液涡旋20 s，然后取200 μL于另一1.5 mL EP管中，加入等量的 10 mmol·L-1乙酸铵水溶液稀释，涡旋20 s后，于14 800 r·min-1离心5 min，取上清液200 μL于进样瓶中，进样10 μL，获得相应峰面积。同时另取200 μL的10 mmol·L-1乙酸铵溶液代替空白血浆，按上述处理，获得相应的峰面积，每一浓度进行3样本分析。以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算基质效应。计算得到血浆中内源性物质对低、高2个浓度血浆样本中头孢地尼的基质效应因子分别为(67.20±5.82)%和(53.37±7.90)%，内标头孢克洛的基质效应因子为(69.95±11.25)%。经内标归一化后低、高2个浓度基质效应因子CV为6.88%和5.27%，均在15%之内。

A.头孢地尼；B.头孢克洛

图2 受试者空白血浆加入头孢地尼溶液(A)和内标工作液(B)色谱图

Fig.2 Chromatogram of blank plasma spiked with cefdinir (A ) and internal standard (B)

A.头孢地尼；B.头孢克洛

图3 受试者第1周期口服头孢地尼胶囊0.1 g后3.5 h血浆样品色谱图

Fig.3 Chromatogram of plasma sample of the volunteer 3.5 h after oral administration of 0.1 g cefdinir at the first cycle

2.3.8 准确度与精密度 按“血浆样本处理”项操作，处理定量下限(10 ng·mL-1)、低(30 ng·mL-1)、中(300 ng·mL-1)、高(1 000 ng·mL-1)4个浓度的QC样本，每浓度平行6个，测定分析批3个，QC样本的浓度以同一分析批的标准曲线计算，根据测定结果计算方法的准确度与精密度。定量下限测定的浓度与理论浓度不超过±20%。低、中、高浓度QC样本测定浓度与理论浓度的RE均不超过±15%，各浓度QC样本的平均测定浓度与理论浓度的RE均不超过±15%，且批内、批间RSD均不大于15%。

2.3.9 提取回收率 从血浆基质中回收得到的分析物的色谱峰面积与分析物纯标准品的峰面积之比为样品的提取回收率。本实验考察头孢地尼低、中、高浓度的QC样本和内标的提取回收率。低、中、高浓度血浆样本中头孢地尼的提取回收率分别为(93.79±2.57)%，(77.38±4.91)%和(81.46±4.82)%；血浆样本中内标头孢克洛的提取回收率为(78.10±1.00)%。

2.3.10 稳定性试验 分别考察血浆样本室温放置2 h稳定性(RSD≤3.27%)，血浆样本处理后进样器放置22 h稳定性(RSD≤4.35%)，血浆样本反复冻融3次稳定性(RSD≤1.9%)，血浆样本冻存30 d稳定性(RSD≤8.50%)。结果表明含头孢地尼的血浆样品稳定性良好。

2.4 血药浓度-时间曲线 24例健康男性受试者餐后单次口服受试制剂和参比制剂后，血浆头孢地尼浓度-时间曲线见图4。

2.5 药动学参数 经DAS3.2.1版软件计算求得24例健康受试者餐后单次口服头孢地尼受试制剂和参比制剂后，血浆头孢地尼的药动学参数见表1。受试制剂与参比制剂各药动学参数采用t检验进行比较，结果差异均无统计学意义(P>0.05)。

图4 24例健康受试者口服参比制剂和受试制剂后血浆头孢地尼平均浓度-时间曲线

Fig 4 Average plasma concentration-time curve after oral administration of reference and test preparation in 24 healthy volunteers

表1 24例健康受试者单次口服头孢地尼受试制剂和参比制剂的药动学参数

药物AUC0-tAUC0-∞(μg·h·mL-1)参比制剂4.12±1.224.53±1.73受试制剂4.35±1.094.53±1.12药物Cmax/(ng·mL-1)tmaxt1/2h参比制剂876±2694.54±1.162.13±1.65受试制剂900±2504.44±0.861.74±0.29

2.6 生物等效性分析 将对数转化后的受试制剂和参比制剂的平均药动学参数Cmax、AUC0-t、AUC0-∞进行方差分析，采用双向单侧t检验及[1-2ɑ]%置信区间法进行生物等效性评价，其中tmax采用非参数法(Wilcoxon秩和检验)检验。结果表明，Cmax、AUC0-t、AUC0-∞均拒绝生物不等效假设；受试制剂经对数转换后的Cmax的90%置信区间为95.4%～111.5%，在参比

制剂的70%～145%内，受试制剂经对数转换后的AUC0-t和AUC0-∞的90%置信区间为100.6%～113.3%和94.6%～112.2%，均在参比制剂的80%～125%内，且受试制剂与参比制剂的tmax经非参数法检验差异无统计学意义(P>0.05)。表明餐后口服受试制剂和参比制剂具有生物等效性。

3 讨论

本试验参考国内外文献[1，4-7]，建立LC-MS/MS的检测方法，头孢地尼和头孢克洛(内标)保留时间均<3 min，样品分析时间短，灵敏度高，定量下限达到10 ng·mL-1，且专属性强。本试验采用甲醇沉淀蛋白法处理血浆样品，方法简单、快速、成本低。试验过程中发现，如果用甲醇沉淀后上清液直接进样灵敏度低，定量下限达不到10 ng·mL-1，而乙酸铵溶液能提高头孢地尼的检测灵敏度，甲醇沉淀蛋白后的上清液用10 mmol·L-1乙酸铵溶液稀释1倍后进样检测，灵敏度大大提高。这可能是因为头孢地尼极性较大，用乙酸铵溶液稀释更加利于头孢地尼的离子化，从而提高头孢地尼的检测灵敏度。

[1] CHEN Z J，ZHANG J，YU J C，et al.Selective method for the determination of cefdinir in human plasma using liquid chromatography electrospray ionization tandam mass spectrometry[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2006，834(1-2)：163-169.

[2] 黄明，张全英，周文佳，等.头孢地尼干混悬剂的生物等效性与人体药动学研究[J].医药导报，2013，32(7)：851-855.

[3] 张明发，辛海涛.头孢地尼的临床应用评价[J].中国医院用药评价与分析，2004，(5)：269-273.

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[7] 国家食品药品监督管理局.化学药物制剂人体生物利用度和生物等效性研究技术指导原则[S].2005.

Study on Bioequivalence of Cefdinir Capsules in Chinese Healthy Volunteers

CHEN Fen1, ZHU Chaoran1, ZHAI Xuejia1, FENG Xia1, DENG Guiping1, GUO Qing2, JIANG Lifen3, LYU Yongning1

(1.DepartmentofPharmacy,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China；2.ShijiazhuangHuaxinPharmaceuticalCo.,Ltd,Shijiazhuang050091,China；3.MedicalExaminationCenterofHebeiGeneralHospital,Shijiazhuang050051,China)

Objective To evaluate postprandial pharmacokinetics and bioequivalence of two preparations of cefdinir capsules in Chinese healthy volunteers. Methods In a two-way cross-over study, 24 healthy male volunteers were divided into two groups randomly and a single dose of cefdinir capsules of test and reference preparation were administered orally, respectively.The concentration in plasma was determined by LC-MS/MS.Pharmacokinetic parameters and bioequivalence were calculated and evaluated by DAS. Results The main pharmacokinetic parameters of test and reference were as follows: AUCt(4.35±1.09) μg·h·mL-1and (4.12±1.22) μg·h·mL-1, AUC0-∞(4.53±1.12) and (4.53±1.73) μg·h·mL-1,t1/2(1.74±0.29) h and (2.13±1.65) h,tmax(4.44±0.86) h and (4.54 土1.16) h,Cmax(900±250) ng·mL-1and (876±269) ng·mL-1. Conclusion The test and reference preparation of cefdinir capsules are bioequivalent.

Cefdinir capsules；Liquid chromatography-tandem mass spectrometry；Pharmacokinetics；Bioequivalence

2014-06-12

2014-08-31

陈芬(1990-)，女，湖北武汉人，硕士，研究方向：药动学及药物相互作用。电话：027-85726073，E-mail：1053228154@qq.com。

吕永宁(1967-)，男，副主任药师，硕士生导师，研究方向：药动学及药物相互作用。电话：027-85726073，E-mail：lvyongning67@hotmail.com。

R978.11；R969.1

A

1004-0781(2015)10-1288-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.10.006