贝那普利和曲尼司特抗糖尿病肾病氧化应激效应比较*

王晓慧，张新，何泳，彭清平，杨国胜，李明梅，刘端，穆昌军

(武汉市第五医院肾内科，武汉 430050)

贝那普利和曲尼司特抗糖尿病肾病氧化应激效应比较*

王晓慧，张新，何泳，彭清平，杨国胜，李明梅，刘端，穆昌军

(武汉市第五医院肾内科，武汉 430050)

目的 观察血管紧张肽转化酶抑制药(ACEI)贝那普利和曲尼司特是否通过抑制硫氧还蛋白(Trx)而产生抗糖尿病肾病(DN)氧化应激效应。方法 雄性SD大鼠40只，随机分为正常对照组、模型对照组、曲尼司特组、贝那普利组，每组10只。正常对照组给予常规饲料喂养；模型对照组、曲尼司特组、贝那普利组给予高糖高脂饮食造糖尿病肾病模型。造模成功后，模型对照组予普通饮食喂养；曲尼司特组予普通饮食喂养及曲尼司特400 mg·kg-1·d-1，灌胃12周；贝那普利组予普通饮食喂养及贝那普利10 mg·kg-1·d-1，灌胃12周。观察各组大鼠24 h尿蛋白定量、血糖、血尿素氮、血肌酐及肾脏病理的变化，应用Western-blot测定Trx的含量。结果 贝那普利组和曲尼司特组与模型对照组比较血糖、尿蛋白、肌酐、尿素氮、肾小球硬化指数、肾重/体质量明显下降，差异有统计学意义(均P<0.05)，贝那普利组和曲尼司特组间差异无统计学意义(P>0.05)。曲尼司特与贝那普利均有效减轻肾脏病理变化，并能上调糖尿病肾病大鼠肾组织中Trx的表达。贝那普利组Trx水平升高较曲尼司特组更显著。 结论 曲尼司特和贝那普利均具有抗糖尿病肾病氧化应激效应，而贝那普利较曲尼司特更显著，其机制除抗纤维化外，还能显著提高Trx的表达，从而抑制氧化应激反应，延缓糖尿病肾病的进展。

血管紧张肽转化酶抑制药；曲尼司特；贝那普利；糖尿病肾病；硫氧还蛋白；氧化应激

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)在许多国家被认为是终末期肾病的主要原因之一，其发病率及患病率日益增加[1]。DN的病因及发病机制较多，其中有研究认为氧化应激可能成为共同通道之一[2]。研究证实血管紧张肽转化酶抑制药(angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI)类药物贝那普利和曲尼司特均具有抗氧化应激效应，能延缓DN的进展[3]。硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)是细胞内重要的氧化还原调节蛋白，具有调节氧化应激效应[4]。因此，测定Trx水平可反映机体的氧化应激水平。笔者在本研究通过检测DN大鼠经贝那普利和曲尼司特治疗前后Trx的表达水平，判断两药抗DN氧化应激的疗效，并对其机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级斯泼累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠40只，雄性，12周龄，由同济医学院动物中心提供，合格证号：C5720030111，实验动物使用许可证号：SYXK(鄂)2005-0033，实验动物生产许可证：SCXK(鄂)2010-0009，体质量180～200 g。动物使用协议由江汉大学动物保健和使用委员会进行审核和批准。动物饲养环境：相对湿度50%～70%，室内温度20～26 ℃，12 h光照、12 h黑暗。

1.2 药品及试药 链脲佐菌素( streptozotocin，STZ，Sigma公司，批号：S0130)；曲尼司特(中国药科大学制药有限公司生产，批号：120109，规格：每粒0.1 g)；贝那普利(北京诺华制药有限公司生产，批号：x1745，规格：每粒10 mg)；电致化学发光(electrochemilu-minescence，ECL)试剂盒(Pierce公司，批号：32109)。

1.3 模型建立与给药方法 自由饮食条件下适应性饲养1周后，建立动物模型。将所有SD大鼠分别从1到40进行编号，运用随机数字表法分为正常对照组10只和造模组30只，正常对照组给予常规饲料喂养，造模组给予高糖高脂饮食。造模组大鼠用6%水合氯醛0.4 mL·(100 g)-1腹腔注射麻醉后，在左背脊柱侧肋弓下肾脏位置切口开腹部，暴露左肾后剥开左肾包膜，结扎肾蒂后切除左肾，逐层缝合切口。造模组喂养1个月后，腹腔注射STZ 40 mg·kg-1，1周后，大鼠禁饮食12 h测空腹血糖，并记录每天尿量，判定2型糖尿病肾病大鼠模型建立成功的标准：尿糖强阳性，空腹血糖≥16.7 mmol·L-1，尿量超过正常对照组50%，尿微量白蛋白>30 mg·d-1；造模组大鼠均符合上述标准，再随机分为模型对照组 (n=10)，予普通饮食喂养；曲尼司特组 (n=10)，予普通饮食喂养及曲尼司特400 mg·kg-1·d-1，灌胃12周；贝那普利组(n=10)，予普通饮食喂养及贝那普利10 mg·kg-1·d-1，灌胃12周。实验过程中所有动物均存活。收集24 h尿液后，所有大鼠均予以安乐死[5-7]。

1.4 尿糖及生化指标检测 尿糖检测采用葡萄糖氧化酶法(干化学法)。大鼠处死后，进行肾/体质量计算和血清生化指标的样本收集。24 h蛋白尿、血糖、血尿素氮、血清肌酐和肾/体质量由日立7600-020-e-自动生化分析仪进行检测。

1.5 病理检测 在模型成功并治疗12周后处死各组大鼠，取出右肾，去包膜后纵向切开，部分组织置于10%固定液中，做糖原染色(periodic acid-schiff stain，PAS)用作组织学分析。肾脏病理变化分析：取PAS染色切片在光镜下观察各组肾脏病变的程度。根据RAIJ等[8]方法评价肾小球硬化程度，每切片肾小球平均硬化分数代表硬化程度。每张标本切片光镜随机选取10个视野，计算各张切片的评分，并计算平均值，即为该标本的肾小球硬化指数。

1.6 Western-blot检查Trx含量 从大鼠肾组织中提取总蛋白：取肾组织样品40 μL+loading buffer(×3) 20 μL，混匀；加入15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrop-horesis，SDS-PAGE)，10 μL/core，冰浴跑胶；冰浴转膜[聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜]，90 mA(恒流)，2 h；TBST溶液洗膜3次；10 mL TBST+5%脱脂奶粉，4 ℃，过夜封闭；加入一抗(兔抗鼠Trx1：100)，室温孵育2 h；再用TBST溶液洗膜3次；加生物素标记的二抗，室温孵育1 h；TBST溶液洗膜5次；荧光底物A液500 μL+B液500 μL，混匀，与膜孵育显影2 min，于暗室底片曝光(ECL试剂盒曝光并显影，扫描显影条带)；采用Phoretix2D软件测定Trx的平均灰度，以同一样品的Trx与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)条带的灰度值比值作为Trx蛋白的相对含量[9]。

2 结果

2.1 生化指标 模型对照组大鼠血糖、尿蛋白、肌酐、尿素氮、肾小球硬化指数、肾质量/体质量各指标与正常对照组比较明显升高，差异有统计学意义(均P<0.05)，贝那普利组和曲尼司特组与模型对照组比较各指标明显下降，差异有统计学意义(均P<0.05)，贝那普利组和曲尼司特组间差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2 肾组织病理改变 PAS染色显示，模型对照组部分肾脏体积增加，细胞肥大，轻度系膜细胞增殖，基底膜增厚，管状上皮细胞变性，肾间质可见单核细胞和淋巴细胞浸润(图1)。贝那普利组、曲尼司特组上述改变均较模型对照组轻，肾小球体积较模型对照组小，系膜增生无模型对照组明显；肾小管上皮病变较轻，间质内单核细胞和淋巴细胞浸润较模型对照组轻。并且观察到贝那普利和曲尼司特组肾小球硬化指数(表1)存在相同的趋势，两组均可以显著减弱肾小球硬化程度。

表1 4组血糖及生化指标检测值

与正常对照组比较，*1P<0.05；与模型对照组比较，*2P<0.05Compared with normal control group，*1P<0.05；Compared with model control group，*2P<0.05

A.正常对照组；B.模型对照组；C.曲尼司特组；D.贝那普利组

2.3 Trx 的表达 结果见图2。Western-blot检测显示，Trx在各组肾组织均有表达，其中正常对照组表达较高，模型对照组表达降低，贝那普利和曲尼司特组表达增高，但较正常对照组偏低，且贝那普利组较曲尼司特组表达水平更高。

3 讨论

RAZA等[10]在实验中观察到，STZ诱导的糖尿病模型中，超氧化物明显增加，这与慢性氧化应激明显有关。本研究中，在STZ诱导成功的大鼠DN模型中，观察到大鼠空腹血糖升高、蛋白尿增加、肾脏体积增大、肾重/体质量比增加、肾小球硬化指数升高等DN的特征，并观察到抗氧化酶水平显著降低，提示氧化应激增强及抗氧化能力降低，这些是DN的发病机制。

氧化和抗氧化的平衡是维持人体内环境稳定的重要因素之一。Trx为细胞内重要的氧化还原调节分子之一[11]，在调节机体的氧化还原反应、抑制细胞凋亡方面起着重要作用[12]，同时它也是一种氧化还原调节蛋白，诱导氧化应激反应[13]。细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS )水平的升高在糖尿病微血管并发症的发病机制中发挥重要作用[14-15]。细胞内ROS水平和氧化应激的存在不仅取决于活性氧的产生率，而且通过内源性抗氧化剂中和与降解，而其机制是通过抗氧化剂Trx结合并抑制的[16]。研究证实，在DN模型中，Trx能通过减少ROS的产生抑制氧化应激，延缓DN的进展[17]。在ANDREW等[18]研究中表明，Trx主要集中表达在肾皮质，能够清除活性氧自由基，避免组织遭受氧化损伤，从而防止糖尿病并发症的产生。因此，提高肾组织中Trx水平有利于DN的预防和治疗。另外，测定血液或组织中Trx的水平亦能够间接反映机体内氧化应激水平。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.曲尼司特组；D.贝那普利组；与正常对照组比较，t=2.235，*1P<0.05；与模型对照组比较，t=2.768，*2P<0.05，t=2.824，*3P<0.01

图2 Western-blot检测4组Trx的表达结果

A.normal control group；B.model control group；C.Tranilast group；D.benazepril group；Compared with normal control group，t=2.235，*1P<0.05；compared with model control group，t=2.768，*2P<0.05，t=2.824，*3P<0.01

Fig.2 Western blot test on Trx expression in four groups

循证医学证实，肾素-血管紧张肽系统( renin-angiotensin system，RAS)通过氧化应激作用过度激活导致血管结构和功能损伤[19]。贝那普利在DN中通过抑制血管紧张肽Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)及抗氧化应激纠正内皮功能紊乱，达到防止疾病进展的作用。本研究证实贝那普利在DN中确实具有抗氧化应激效应，能延缓DN的进展，这与以往学者的研究是一致的。

曲尼司特是临床上应用已久的药物，由于其具有抗炎及抗纤维化的作用，已经被应用于肾脏疾病的治疗，证实其具有抗氧化应激效应[20]，其肾脏保护作用日益受到关注，确切机制尚未明确。有学者证实在实验性DN模型中，曲尼司特能增加Trx的表达，减弱氧化应激效应，从而延缓DN的进展[3]。本研究证实曲尼司特能降低血清尿素氮、血肌酐和尿蛋白，提示有一定的肾脏保护作用。且曲尼司特组Trx水平升高，病理改变减轻，证实其在DN中可能是通过增加Trx的表达从而起到抗氧化应激作用，这与文献[3]结果相符。

本实验中比较贝那普利和曲尼司特对12周末DN大鼠的尿蛋白定量及肾脏病理的改变的影响，及肾组织中Trx的表达情况，及其与肾纤维化的关系，结果显示 Trx在改善DN肾组织纤维化中起着重要的作用，且贝那普利、曲尼司特均能降低DN大鼠的尿蛋白，改善肾功能，减轻肾小球硬化及肾间质纤维化，两用药组间差异无统计学意义，但贝那普利组Trx表达水平较曲尼司特组高，提示贝那普利减轻氧化应激反应更有效。

总之，在这次实验中更进一步证实贝那普利和曲尼司特两种药物的抗氧化应激效应，氧化应激在减少Trx的表达和DN发生发展中起到重要作用，其机制可能是高血糖引起Trx表达减少，进而使调节氧化应激的非酶系统抑制。Trx可能成为今后抗DN氧化应激的新靶点。另外，曲尼司特虽早已应用于临床，但目前对于曲尼司特保护肾脏的作用大部分研究多局限于动物实验或体外研究，由于种族差异，其对人体是否也具有同样的保护DN的作用还有待于进一步的临床研究。

[1] HALLAN S I，CORESH J，ASTOR B C，et al.International comparison of the relationship of chronic kidney disease prevalence and ESRD risk[J].J Am Soc Nephrol，2006，17(8)：2275-2284.

[2] ELMARAKBY A A，SULLIVAN J C.Relationship between oxidative stress and inflammatory cytokines in diabetic nephropathy[J].Cardiovasc Ther，2012，30(1)：49-59.

[3] TAN S M，ZHANG Y，COX A J，et al.Tranilast attenuates the up-regulation of thioredoxin-interacting protein and oxidative stress in an experimental model of diabetic nephropathy[J].Nephrol Dial Transplant，2011，26(1)：100-110.

[4] HAMADA Y，FUKAQAWA M.A possible role of thioredoxin interacting protein in the pathogenesis of streptozotocin-induced diabetic nephropathy[J].Kobe J Med Sci，2007，53(1-2)：53-61.

[5] TALPUR N，ECHARD B，INGRAM C，et al.Effects of a novel formulation of essential oil on glucose-insulin etabolism in diabetic and hypertensive rats：a pilot study[J].Diabetes Obes Metab，2005，7(2)：193-199.

[6] SAINI K S，THOMPSON C，WINTERFORD C M，et al.Streptoz otocin at low doses induces apoptosis and at high doses causes necrosis in a murine pancreatic beta cell line，INS-1[J].Biochem Mol Biol Int，1996，39(6) ： 1229-1236.

[7] KANG M J，INGRAM A，LY H，et al.Effects of diabetes and hypertension on glomerular transforming growth factor-beta receptor expression[J].Kidney Int，2000，58(4)： 1677-1685.

[8] RAIJ L，AZAR S，KEANE W.Mesangial immune injury，hypertension，and progressive glomerular damage in Dahl rats[J].Kidney Int，1984，26(2)：137-143.

[9] 高卫，谷利，杨荟敏，张红.硫氧还蛋白-1(Trx1)氧化还原状态的检测[J].中国生物化学与分子生物学报，2010，26(4)：374-379.

[10] RAZA H，PRABU S K，JOHN A，et al.Impaired mito-chondrial respiratory functions and oxidative stress in streptozotocin-induced diabetic rats[J].Int J Mol Sci，2011，12(5)：3133-3147.

[11] SUN J S，LI Y X，SUN L.Cynoglossus semilaevis thio-redoxin： a reductase and an antioxidant with immunostimulatory property[J].Cell Stress Chaperones，2012，17(4)：445-455.

[12] WAGNER C，SUDATI J H，CRISTINA W.Invivoandinvitroinhibition of mice thioredoxin reductase by methylmercury[J].Biometals，2010，23(6)：1171-1177.

[13] KASUNO K，KIMURA H，TAKAHASHI N，et al.Clinical application of urinary redox regulating protein，thioredoxin[J].Rinsho Byori，2011，59(2)：189-195.

[14] GIACCO F，BROWNLEE M.Oxidative stress and diabetic complications[J].Circ Res，2010，107(9)：1058-1070.

[15] SINGH D K，WINOCOUR P，FARRINGTON K.Oxidative stress in early diabetic nephropathy：fueling the fire[J].Nat Rev Endocrinol，2011，7(3)：176-184.

[16] LI X，RONG Y，ZHANG M，et al.Up-regulation of thiore-doxin interacting protein(TxNIP) by p38 MAPK and FOXO1 contributes to the impaired thioredoxin activity and increased ROS in glucose-treated endothelial cells[J].Biochem Biophys Res Comm，2009，381(4)：660-665.

[17] KOHARYOVA M，KOLAROVA M.Oxidative stress and th-ioredoxin system[J].Gen Physiol Biophys，2008，27(2)：71-84.

[18] ANDREW A，RICHARD E G，KERRI T，et al.Expression，localization，and function of the thioredoxin system in diabetic nephropathy[J].J Am Soc Nephrol，2009，20(4)：730-741.

[19] GWATHMEY T M，PENDERGRASS K D，REID S D，et al.Angiotensin-(1-7)-angiotensin-converting enzyme 2 attenuates reactive oxygen species formation to angiotensin II within the cell nucleus[J].Hypertension，2010，55(1)： 166-171.

[20] YANG X，FENG L，LI C J，et al.Tranilast alleviates endo-thelial dysfunctions and insulin resistance via preserving glutathione peroxidase 1 in rats fed a high-fat emulsion[J].J Pharmacol Sci，2014，124(1)：18-30.

Comparison of Effect on Antioxidative Stress Between Benezepril and Tranilast in Diabetic Nephropathy Rat

WANG Xiaohui，ZHANG Xin，HE Yong，PENG Qingping，YANG Guosheng，LI Mingmei，LIU Duan，MU Changjun

(DepartmentofNephrology，theFifthHospitalofWuhanCity，Wuhan430050，China)

Objective To investigate ACEI(benazepril)and tranilast exert renoprotective properties in diabetic nephropathy(DN)through the inhibition of thioredoxin(Trx). Methods Forty male SD rats were randomly divided into control group，model control group，tranilast group and benazepril group (n=10 each).Normal control group was fed with normal diet.Other groups were fed with high-glucose high-fat diet to make model control models.Rats in DN，tranilast，and benazepril groups were fed with normal diet，400 mg·kg-1·d-1tranilast plus normal diet，and 10 mg·kg-1·d-1benazepril plus normal diet，respectively，via oral gavage for 12 weeks.The 24-hour proteinuria，blood glucose(BG)，blood urea nitrogen (BUN)，serum creatinine (Scr) and renal pathology changes were detected.Expression of Trx was measured by Western-blot. Results The 24 h urine protein，BG，BUN，Scr，kidney/body weight，and glomerular sclerosis index were significantly decreased in tranilast group and benazepril group，as compaired with model control group (P<0.05)，but there was no statistical difference between the two drug groups (P>0.05).Both tranilast and benazepril can reduce renal pathological changes，and can increase the expression of Trx of DN rats，but benazepril had a more significant effect on increasing Trx expression. Conclusion Both tranilast and benazepril have renoprotective function in DN，and benazepril is more effective in delaying the progression of diabetic nephropathy by increasing Trx expression and decreasomg oxidative stress.

Angiotensin converting enzyme inhibitors； Tranilast； Benazepril； Diabetic nephropathy；Thioredoxin； Antioxidative stress

2015-02-15

2015-04-16

*武汉市卫生局科研基金项目(WX10C24)

王晓慧(1972-)，女，湖北武汉人，副主任医师，博士，主要从事慢性肾脏病研究。电话：(0)13971084589，E-mail：390638252@qq.com。

穆昌军(1969-)，男，湖北武汉人，副主任医师，学士，主要从事肾脏病研究。电话：(0)13871460157，E-mail：718010821@qq.com。

R972.4；R587.1

A

1004-0781(2015)10-1276-05

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.10.003