QuEChERS净化-液相色谱-串联质谱法测定茶叶中氯噻啉

刘松南, 赵新颖, 董晓倩, 许雯雯, 赵 榕

(1. 北京市茶叶质量监督检验站, 北京 100162; 2. 北京市理化分析测试中心, 有机材料检测技术与质量评价北京市重点实验室, 北京 100089)

技术与应用

QuEChERS净化-液相色谱-串联质谱法测定茶叶中氯噻啉

刘松南1*, 赵新颖2, 董晓倩1, 许雯雯1, 赵 榕1

(1. 北京市茶叶质量监督检验站, 北京 100162; 2. 北京市理化分析测试中心, 有机材料检测技术与质量评价北京市重点实验室, 北京 100089)

建立了茶叶中农药氯噻啉残留的液相色谱-串联质谱检测方法。茶叶样品用乙腈提取,提取液经QuEChERS法净化,利用PSA(N-丙基乙二胺)、C18、GCB(石墨化炭黑)等吸附剂材料进一步去除杂质,净化液经过离心后取上清液以水等体积稀释。以乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液为流动相,在0.30 mL/min流速下梯度洗脱,用C18色谱柱进行液相色谱分离,电喷雾正离子模式电离(ESI+),选择反应监测(SRM)模式检测,外标法定量。结果表明:氯噻啉在1～500 μg/L范围内线性关系良好(相关系数r为0.999 9),定量限为0.01 mg/kg(S/N≥10),在乌龙茶和绿茶中3个添加水平(0.01、0.3和3 mg/kg)的平均回收率为87.0%～101.0%,相对标准偏差(RSD,n=7)在2.1%～13.1%之间。对多种茶叶的测定结果表明,该方法操作简便、成本低、准确性高、特异性好、分析速度快,可以对茶叶中氯噻啉残留进行定性和定量检测。

QuEChERS;液相色谱-串联质谱;氯噻啉;茶叶

氯噻啉(imidaclothiz, C7H8ClN5O2S)是我国在2002年研发的一种新型烟碱类杀虫剂[1]。它通过作用于烟酸乙酰胆碱酯酶受体阻滞害虫的中枢神经正常传导,可防治十字花科蔬菜蚜虫、柑橘蚜虫、温室白粉虱、水稻飞虱、茶树叶蝉等[2]。氯噻啉基本取代了甲胺磷等5种禁止生产、销售和使用的高毒农药,得到广泛应用[3]。2014年,我国最新修订的《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》中规定了茶叶中氯噻啉的残留限量为3.0 mg/kg[4],但没有规定其检测方法。目前,国内也没有关于茶叶中氯噻啉农药残留检测的标准方法。国内外有关氯噻啉的检测方法主要有液相色谱法[5]、酶联免疫法[6]、毛细管电泳法[7]、液相色谱-串联质谱法[8,9]和气相色谱-质谱法[10]。以上报道主要涉及水稻、蔬菜和水果等检测对象,仅有陆小磊等[9]报道了茶叶中氯噻啉的检测方法。该方法利用乙腈匀质提取、GC-e/NH2固相萃取柱净化、高效液相色谱-电喷雾离子化质谱测定,可以实现茶叶中氯噻啉残留的检测。但这种方法的前处理过程较为繁琐,需要进行固相萃取和多次旋转蒸发及氮吹等操作,梯度洗脱程序时间为50 min,不利于大量样品的快速检测。

QuEChERS前处理方法是由Anastassiades等[11]于2003年首次提出的。与固相萃取柱净化法相比,该方法具有速度快、回收率高、稳定性好、溶剂使用量少、样品制备简便等优点,在茶叶及其他食品的农残分析中得到广泛应用。本文利用乙腈提取、QuEChERS法净化,液相色谱-串联质谱法测定茶叶中氯噻啉残留。方法简单、快速,可以为茶叶中氯噻啉农药残留的检测提供技术保障。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

TSQ Quantum Ultra EMR液相色谱-串联质谱仪,配有电喷雾离子源(美国Thermo Fisher公司); AEL200分析天平,感量0.1 mg(日本岛津公司); KDC-140HR离心机,配有2 mL、8 mL转头(安徽中科中佳科学仪器有限公司); Milli-Q高纯水发生器(美国Millipore公司); FW135粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)。

氯噻啉标准样品购自上海安谱实验科技股份有限公司(CAS 105843-36-5,纯度≥96%);乙腈(色谱纯)和甲酸(质谱级)购自美国Thermo Fisher公司;氯化钠和无水硫酸镁(分析纯)购自天津大茂化学试剂厂;PSA(N-丙基乙二胺,primary secondary amine)吸附剂(40～60 μm)、ODS C18吸附剂(50 μm, 6 nm)和GCB吸附剂(石墨化炭黑,graphitized carbon black, 120～400目)购自天津博纳艾杰尔科技有限公司。茶叶样品均购于北京市内的超市、茶叶店和茶叶生产厂,产地涵盖福建、浙江、四川、云南和安徽,其中绿茶17个、乌龙茶14个、茉莉花茶12个、红茶11个、黑茶9个、白茶3个、黄茶1个。实验用水均为超纯水(经Milli-Q高纯水发生器纯化)。

1.2 溶液的配制

标准储备液:准确称取10 mg(准确到0.1 mg)氯噻啉标准样品于100 mL容量瓶中,乙腈定容至刻度,配制成100 mg/L的标准溶液,4 ℃冷藏保存,有效期6个月。标准工作液:量取标准储备液,用乙腈-水(1∶1, v/v)分别稀释成1.0、50、100、200、500 μg/L的系列标准工作溶液,使用之前现配。

1.3 色谱和质谱条件

色谱柱:Hypersil GOLD C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱温:40 ℃;进样量:10 μL;流速:0.30 mL/min;流动相:A为含0.1%(v/v)甲酸的水溶液,B为乙腈。梯度洗脱程序:0～1.0 min, 99%A; 1.0～5.0 min, 99%A～5%A; 5.0～8.5 min, 5%A; 8.5～9.0 min, 5%A～99%A; 9.0～10.0 min, 99%A。

电喷雾离子化正离子(ESI+)模式;扫描模式:选择反应监测(SRM);喷雾电压:4 000 V;气化温度:300 ℃;鞘气流速:15 mL/min;辅助气流速:15 mL/min;离子传输管温度:320 ℃;碰撞气体(氩气)压力: 0.2 Pa; SRM监测离子对:m/z262.0/181.1(定量)和262.0/122.2;管透镜补偿电压(tube lens offset voltage): 100 V;碰撞电压:14 V和26 V;保留时间:4.7 min。

1.4 样品前处理

茶叶样品用粉碎机粉碎,过600～1 000 μm孔径筛。准确称取1.000 0 g样品粉末置于8 mL离心管中,加入0.50 g氯化钠、0.20 g无水硫酸镁、5.00 mL乙腈,涡旋振荡1 min,静置浸泡10 min,再次涡旋振荡1 min,于5 000 r/min离心3 min,取上清液1.00 mL,待净化。将1.00 mL提取液置于2 mL离心管中,依次加入GCB、PSA和C18吸附剂各0.050 g及无水硫酸镁0.15 g,涡旋振荡1 min,于5 000 r/min离心3 min。取上清液0.50 mL于2 mL离心管中,加入0.50 mL水,摇匀,经0.22 μm有机微孔滤膜过滤,待分析测试。

2 结果讨论

2.1 质谱参数的选择

采用ESI+模式,以1 mg/L氯噻啉标准样品溶液进行质谱参数优化,确定特征母离子和子离子。氯噻啉农药标准品的二级碎片离子主要有m/z181.1、122.2、123.2、132.1、95.2等。进一步优化二级碎片离子的管透镜补偿电压、碰撞电压等参数。根据二级离子的响应强度和特异性,选取m/z262.0/181.1为定量离子,m/z262.0/122.2为定性离子,碰撞电压分别为14 V和26 V,管透镜补偿电压为100 V。

2.2 流动相的选择

比较了甲醇-水和乙腈-水两个流动相体系对分离的影响。实验结果表明,氯噻啉在上述两种体系中的峰形接近,但在乙腈-水体系下保留时间更短。这是由于乙腈的极性弱于甲醇,在反相液相色谱中对氯噻啉的洗脱能力强于甲醇,所以出峰更早。因此选择乙腈-水体系作为流动相。同时,在乙腈-水流动相中添加了0.1%(v/v)的甲酸以增加氯噻啉在正离子模式下的离子化效率[12],改变洗脱程序以缩短氯噻啉的保留时间。在优化条件下,氯噻啉的保留时间为4.7 min,全部梯度程序时间为10 min,可以实现氯噻啉的较快速检测。

2.3 提取条件的选择

2.3.1提取溶剂

考察了乙腈、乙酸乙酯、丙酮和甲醇4种常见的提取溶剂对氯噻啉提取效率的影响。结果表明,氯噻啉的峰面积按照乙腈≈甲醇>丙酮>乙酸乙酯的顺序排列。但是以甲醇作为提取溶剂时同时提取出的干扰物质也较多,定量离子通道有干扰峰存在,基线噪声也较高,因此实验选用乙腈为提取溶剂。

2.3.2干扰组分

图1 4种溶剂对茶叶样品中干扰组分的提取情况Fig.1 Extraction of interference components in tea samples with four solvents

咖啡因是茶叶等少数植物的特有成分,茶多酚是茶叶中含量最多的成分,叶绿素是茶叶色素的主要成分之一[13]。分别以乙腈、乙酸乙酯、丙酮和甲醇4种溶剂进行提取,对提取液和净化液中咖啡因、茶多酚和叶绿素3种茶叶中主要干扰成分进行测定。咖啡因参照GB/T 8312-2013以液相色谱法进行检测,茶多酚参照GB/T 8313-2008方法二紫外-可见分光光度计法进行检测,叶绿素参照GB/T 22182-2008紫外-可见分光光度计法进行检测。实验结果表明,相较于其他3种溶剂,乙腈作为提取溶剂时提取出的咖啡因和叶绿素最少,提取出的茶多酚仅多于乙酸乙酯(见图1)。因此,选择乙腈为提取溶剂可以最少地提取茶叶中的干扰组分,且乙腈与液相色谱-串联质谱流动相基本一致,减少溶剂置换操作。此外,参考AOAC 2007.01方法,在样品中加入无水硫酸镁脱除水分,加入氯化钠，通过盐析作用提高提取效率,从而增加提取方法的稳定性和提取效率。

2.4 净化方式

茶叶中含有大量的色素、生物碱、多酚和有机酸等物质,提取液需要进一步净化处理,以减少色谱柱和质谱系统的污染,确保检测结果的准确性。PSA能有效去除脂肪酸、碳水化合物、酚类和少量色素;GCB能去除色素、类胡萝卜素、固醇和平面结构的干扰杂质[14]; C18对非极性物质有较高的容量,对色素、甾醇和维生素的去除能力较强[15]。本文参照AOAC 2007.01的净化方法,在净化过程中依次加入GCB、PSA和C18等吸附剂各0.050 g、无水硫酸镁0.15 g。实验结果表明,经过本方法净化过的样品溶液中咖啡因、茶多酚和叶绿素的含量分别为94、19.4和0.005 2 mg/L。计算得到本方法对咖啡因和茶多酚的去除率分别为99.95%和98.66%,提取液中的色素肉眼不可见。以上结果说明本方法可有效去除茶叶中的主要干扰组分。

2.5 样品溶剂的选择

考察了不同体积比的乙腈-水溶液作为溶剂溶解样品时对色谱峰形的影响。结果表明,纯乙腈作为样品溶剂时氯噻啉的色谱峰展宽最严重;随着乙腈含量的下降峰形变窄、柱效增加,当乙腈含量低于50%(v/v)后,峰形不再有显著变化。以纯乙腈为溶剂进样时,因样品溶剂和流动相不匹配而产生溶剂效应,导致色谱峰展宽,对乙腈溶剂进行稀释后可以有效缓解这种效应的影响。因此,选择乙腈-水(1∶1, v/v)作为氯噻啉的样品溶解溶剂可以确保最佳的色谱峰形和检出限。

2.6 线性关系、检出限和定量限

分别配制1.0、50、100、200和500 μg/L氯噻啉标准溶液并进行液相色谱-串联质谱分析。结果表明,在1.0～500 μg/L范围内线性关系良好,回归方程为y=299.9+6 874.21x(r=0.999 9)。当茶叶中氯噻啉的含量为GB 2763-2014中规定的茶叶类食品限量值3.0 mg/kg时,参照1.4节方法处理后对应最终测试液中氯噻啉的质量浓度为300 μg/L,处于校正曲线的中段,有利于对氯噻啉含量处于上述限量值附近样品进行准确定量。以不含氯噻啉的茶叶样品提取液稀释氯噻啉标准溶液,当定量离子和定性离子色谱峰的S/N≥3时,样品中对应的氯噻啉含量为0.005 mg/kg,即本方法的检出限。当定量离子色谱峰的S/N≥10且定性离子色谱峰的S/N≥3时,样品中氯噻啉对应的含量为0.01 mg/kg,即本方法的定量限。以上结果符合氯噻啉残留的判定要求[4]。

2.7 回收率和精密度

选取色素及浸出物最多的茶叶品种乌龙茶和绿茶为样品,分别添加0.010 mg/kg(方法定量限)、0.30 mg/kg、3.0 mg/kg(GB 2763-2014中的限量值)的氯噻啉,考察方法的回收率和精密度。实验结果表明,乌龙茶的加标平均回收率为88.5%～101.0%,相对标准偏差为2.7%～13.1%;绿茶的加标平均回收率为87.0%～101.0%,相对标准偏差为2.1%～11.7%(见表1)。加标回收率和精密度均符合检测方法的相关要求[16]。

表1 茶叶样品中氯噻啉的平均加标回收率和精密度(n=7)

2.8 空白样品和基质效应

以不含氯噻啉的黑茶、乌龙茶、绿茶、红茶、白茶、黄茶和茉莉花茶7种茶叶为样品,用本方法进行分析。实验结果表明,空白样品均不含氯噻啉,定量离子通道离子强度(NL)均小于5×102,谱图不存在干扰情况。分别以上述7种空白提取液作为标准溶液的稀释液,以各组分的峰面积(Y)对质量浓度(X, μg/mL)绘制基质加标标准曲线,将其斜率与标准品的标准曲线的斜率相比,斜率比为97.1%～102.2%。结果表明以本方法测定上述7种茶叶中氯噻啉残留量时的基质效应不明显。

2.9 特异性

在茶叶样品中添加氯噻啉和10种常见农药(杀螟丹、多菌灵、灭多威、噻虫嗪、吡虫啉、氯噻啉、啶虫脒、除虫脲、腐霉利、喹螨醚、丁醚脲),按本方法进行测定,考察方法的特异性。实验结果表明,其余10种常见农药成分没有对氯噻啉的检测造成干扰。

2.10 样品检测

采用本方法对67个茶叶样品进行检测,只有1个样品检出氯噻啉,含量为0.055 mg/kg。检出氯噻啉的茶叶样品的色谱图见图2。

图2 含有氯噻啉农药残留的茶叶色谱图Fig.2 Chromatograms of imidaclothiz residue in tea sample a. total ion chromatogram (TIC); b. selective reaction monitoring (SRM) transitions for quantification; c. SRM transitions for confirmation.

3 结论

本方法将QuEChERS法和液相色谱-串联质谱结合,兼具有QuEChERS的便捷、快速、低成本、环保和液相色谱-串联质谱的高选择性、高灵敏度等优点。方法学结果均符合《实验室质量控制规范 食品理化检测(GB/T 27404-2008)》的相关规定,能满足茶叶中氯噻啉农药残留的检测要求,是对《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量(GB 2763-2014)》的有效补充。

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[16] GB/T 27404-2008

Determination of imidaclothiz in tea by QuEChERS cleanup and liquid chromatography-tandem mass spectrometry

LIU Songnan1*, ZHAO Xinying2, DONG Xiaoqian1, XU Wenwen1, ZHAO Rong1

(1.BeijingTeaQualifySupervisionandInspectionStation,Beijing100162,China, 2.BeijingCentreforPhysicalandChemicalAnalysis,BeijingKeyLaboratoryofOrganicMaterialsTestingTechnology&QualityEvaluation,Beijing100089,China)

The method for the determination of imidaclothiz residue in tea by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) has been developed. The imidaclothiz in tea was extracted by acetonitrile and purified by QuEChERS with PSA (primary secondary amine), C18, GCB (graphitized carbon black) as the adsorbents. The purified solution was centrifuged and the supernatant was diluted with water of equal volume. The separation was performed on a C18column with a gradient elution program of acetonitrile (containing 0.1% (v/v) formic acid) and water at a flow rate of 0.30 mL/min. The mass spectrometer was carried out with electrospray ion source in the positive mode (ESI+) and selective reaction monitoring (SRM), quantified by external standard solution. The results showed that the mass concentration of imidaclothiz in the range of 1 to 500 μg/L was linearly correlated with the peak area, and the correlation coefficient (r) was 0.999 9. The limit of quantification (LOQ,S/N≥10) was 0.01 mg/kg. The recoveries in oolong tea and green tea at three spiked levels (0.01, 0.3 and 3 mg/kg) varied from 87.0%-101.0% and the relative standard deviations (RSDs,n=7) were between 2.1% and 13.1%. The real sample tests showed that the method is simple, cheap, accurate, specific, rapid, and suitable for the qualitative and quantitative confirmation of imidaclothiz residue in tea.

QuEChERS; liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS); imidaclothiz; tea

10.3724/SP.J.1123.2015.07006

2015-07-06

O658

:A

:1000-8713(2015)11-1205-05

*通讯联系人.Tel:(010)60221648;E-mail:lsnmail@qq.com.