国产法医遗传分析仪的适用性研究

管 桦，张 涛，赵 颖，荣海博，金 川，陈 力

(公安部第一研究所，北京 102200)

0 引言

在日常法医DNA分析中常采用毛细管电泳对短串联重复序列(short tandem repeat，STR)［1-5］，线粒体 DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)序列［6-7］和单核甘酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)［8-11］进行检测分析，其分析结果为司法断案提供重要依据，因此毛细管电泳仪器已成为法医DNA分型检验流程中发展最快的一类精密检测设备［12］。法医遗传分析仪便是以毛细管凝胶电泳-激光激发荧光检测系统为核心进行DNA分离检验，此系统较以往DNA分析手段已显现出诸多优势［4，13-15］:(1)注胶、进样、分离和检测 DNA 片段完全自动化;(2)耗时短;(3)软件收集、处理数据自动化，效率更高;(4)可对数据实时查看;(5)结果更加精确;(6)更高的分离分辨率;(7)结果具有高度可重复性;(8)样品污染的可能性更小;(9)样品用量少;(10)危险废物的产生大大降低。

目前，我国各法医实验室在开展DNA检验的过程中使用的遗传分析仪完全依赖进口，从仪器整机到零部件的更换、维护一系列的环节所产生的费用相当高昂，这严重制约了DNA检测技术在公安一线的推广应用，也限制了我国法医DNA检测技术的进一步发展。针对这一问题，在“十一五”国家科技支撑计划项目资金的支持下，我所研发出“GA118-16A型”国产法医遗传分析仪，填补了国内相关领域技术空白。本文将“GA118-16A型”国产法医遗传分析仪与当前法医物证实验室常用的几种试剂盒所配套的标准物结合实验，研究了仪器的均一性、检测精确度和对STR分型的准确性，并与国外同类仪器进行平行测试，为国产法医遗传分析仪的实际应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

研究对象为“十一五”国家科技支撑计划法医DNA专用检测平台关键技术研究项目中研发的“GA118-16A型”国产法医遗传分析仪。

1.2 仪器及试剂

“GA118-16A型”国产法医遗传分析仪(公安部第一研究所提供);3130xl遗传分析仪(Applied Biosystems公司);台式离心机(SIGMA);PCR仪(9700型，Applied Biosystems公司);超纯水仪(ELGA)。

IdentifilerTM扩增试剂盒(Applied Biosystems公司);IdentifilerTMPlus扩增试剂盒(Applied Biosystems公司);DNATyperTM19扩增试剂盒(公安部物证鉴定中心);AGCU17+1扩增试剂盒(中德美联);GeneScan -500LIZ(Applied Biosystems公司);甲酰胺;电泳缓冲液;POP4凝胶(Applied Biosystems公司);DNA IQTMSystem试剂盒(Promega公司)。

1.3 实验准备与方法

1.3.1 仪器平台

测试工作将在两个不同的法医DNA检测平台上平行展开:平台一为国外法医DNA检测平台:3130xl遗传分析仪及配套的法医DNA检测消耗品，包括POP4凝胶、1*buffer缓冲液、甲酰胺、16道毛细管阵列，耗材均购自于美国Applied Biosystems公司;平台二为国产法医 DNA检测平台:“GA118-16A型”法医遗传分析仪及配套的法医DNA检测消耗品，包括POP4凝胶、1*buffer缓冲液、甲酰胺、16道毛细管阵列，耗材均购自于美国Applied Biosystems公司。

1.3.2 实验方法

按照 GeneScanTM-500LIZ、Typer500和 AGCU Marker Size-500内标标准物的说明书要求，配制内标检测标准物，并分装于3个96孔板上，每板各一组，在统一孔位添加1μL各自配套的等位基因分型标准物(allelic ladder)试剂，每个平台上每种样品重复4次，进行遗传分析仪均一性研究。

按照说明书要求，分别配制IdentifilerTMallelic ladder、DNATyperTM19 allelic ladder和 17+1 allelic ladder各两组，分装于3个96孔板上，每个平台上每种标准物各重复4次，研究仪器的检测精确度。

扩增9947A阳性对照标准物，IdentifilerTM扩增试剂盒、IdentifilerTMPlus扩增试剂盒、DNATyperTM19扩增试剂盒和AGCU17+1扩增试剂盒均采用10 μL扩增体系。每种扩增产物按试剂盒说明要求配制成检测样品，分装于两个96孔板，每种样品每板各添加一组，分别在两个平台的A、B盘进行检测，各重复4次，进行STR分型准确性研究。

分别取92份现场取得的唾液样本和184份用作建库的FTA血卡样本，依照IdentifilerTMPlus扩增试剂盒、DNATyperTM19扩增试剂盒和AGCU17+1扩增试剂盒说明书要求进行扩增，IdentifilerTM扩增试剂盒扩增前使用DNA IQTMSystem试剂盒对DNA样本进行磁珠法提取，实验重复2次，完成不同类型样本适用性分析。

以上各种样品均分成两板，分别在两个平台上进行平行实验。

1.3.3 软件分析

利用GeneMapper ID v3.2软件分析全部电泳结果，Origin v8.0软件进行数据分析和绘图。

2 结果

2.1 检测均一性研究

均一性是指仪器运行一组样品时，16根泳道电泳结果的差异小，这可以通过片段峰高来判定。两个平台分别对两种内标标准物电泳检测的结果通过GeneMapper ID v3.2软件分析，并汇总各组16根泳道内标峰高数据，取其中比较灵敏的250 bp片段及大片段490 bp和500 bp进行绘图，结果如图1、图2和图 3所示。可知，两个平台对 GeneScanTM-500LIZ、Typer500和 AGCU Marker Size-500均能成功分型，无片段丢失现象，并且谱峰清晰均一完整、判型准确，所有峰值均大于50相对荧光单位(RFU)。对3130xl与GA118-16A的一组16根泳道中的250 bp、490 bp和500 bp片段峰高进行均一性比较，图1、图2、图3表明，16根泳道同一片段峰高比较均一，且两个平台所测片段峰值分布趋势基本一致，两个平台的检测结果显示，Typer500的峰高均一性最好，而平台二较平台一峰值偏高。

2.2 检测精确度研究

精确度是指在STR分型中，仪器能够达到分离1 bp差异片段的分离程度。3种等位基因分型标准物各自全部STR基因座和1个Amelogenin性别基因的片段分型准确，无等位基因丢失现象，并且峰高均衡，峰型良好。两个平台对IdentifilerTMallelic ladder的片段精确度检测结果见图4，对DNATyperTM19 allelic ladder的检测结果见图5，对17+1 allelic ladder的检测结果见图6。由图4、图5、图6显示，两个平台等位基因分型标准物中的所有等位基因片段的标准偏差均远小于阈值0.15 bp，意味着在两个平台上，99.7%的具有相同大小的样品等位基因片段能够落在相应的等位基因分型标准物片段的±0.45 bp范围内。由图4、图5和图6所示，平台1对于3种等位基因分型标准物片段的最大标准偏差分别为 0.115 bp、0.117 bp 和0.129 bp，平台二的最大标准偏差分别为 0.124 bp、0.127 bp 和 0.131 bp，各组平行实验中，平台二与平台一之差分别在0.09 bp、0.01 bp和0.002 bp范围内(图形上、下方的“小叉号”分别代表该组数据的最大、最小值［绝对值］，柱形中的“小方形”的中心表示该组数据的算术平均值，柱形中的“横线”代表该组数据的中间数据点)。

图1 两个检测平台16根泳道的GeneScan TM-500LIZ峰高均一性比较

图2 两个检测平台16根泳道的Typer500峰高均一性比较

图3 两个检测平台16根泳道的AGCU Marker Size-500峰高均一性比较

2.3 阳性对照标准物的STR分型准确性研究

准确性是指仪器检验样品获得“真实”结果的能力，即检测结果与真实结果的一致程度。IdentifilerTM试剂盒、IdentifilerTMPlus试剂盒、DNATyperTM19试剂盒和AGCU17+1试剂盒对各自配套的9947A阳性对照标准物进行扩增，STR分型结果显示，两个平台上4种阳性对照品均100%分型，并且两个平台检测结果完全一致(见表1)。

图4 两个平台对Identifiler TM allelic ladder检测精确度分析

图5 两个平台对DNATyper TM 19 allelic ladder检测精确度分析

图6 两个平台对17+1 allelic ladder检测精确度分析

表1 阳性对照标准物在各试剂盒扩增下分型结果比较

2.4 实际样本适用性研究

对案件现场检材样本和建库样本分别进行检测，验证仪器对不同类型的实际检材的适用性。结果表明，92份案件现场检材样本和184份建库样本通过IdentifilerTM试剂盒、IdentifilerTMPlus试剂盒、DNATyperTM19试剂盒和AGCU17+1试剂盒扩增，在两个平台上均获得了准确、完整的STR分型，无等位基因丢失现象，并且峰高均衡，两个平台检出的STR分型结果100%一致(见表2)。

表2 实际样本DNA在各试剂盒扩增下分型结果比较

3 讨论

在法庭科学领域，遗传分析仪已发展成为一种灵活、便捷的分析检测仪器，其检测能力涵盖片段分析，DNA测序，单核苷酸多态性分型等诸多方面，被法医物证学实验室所广泛使用。本实验采用我所研制的“GA118-16A型”国产法医遗传分析仪结合现今法庭科学实验室常用的几种试剂盒所配套的标准物进行实验，并以目前法医DNA检测的主流产品3130xl遗传分析仪为平行实验对象。由于内标标准物浓度已知，且性质稳定，因此对内标片段峰值高度的检测可以了解仪器的均一性能。实验结果表明，“GA118-16A”平台对 GeneScanTM-500LIZ、Typer500和AGCU Marked Size-500均能100%成功分型，并且峰型清晰完整、判型准确，所有峰值均大于50相对荧光单位(RFU)。16根泳道检测结果比较，同一片段峰高较均一。与3130xl平台所测片段峰值分布趋势基本一致，且“GA118-16A”平台灵敏度更高。

“GA118-16A”平台能够准确分型IdentifilerTMallelic ladder、DNATyperTM19 allelic ladder和 17+1 allelic ladder 1各自全部STR基因座和1个Amelogenin性别基因的片段，所有等位基因片段的标准偏差均远小于阈值0.15 bp，因此可以保证样品等位基因片段能够被成功分型，分辨力可达1 bp的片段差异［16］。两个平台比较显示，“GA118-16A”平台和3130xl平台对上述3种allelic ladder检测所得效果一致。

对仪器准确性的探讨，使用IdentifilerTM试剂盒、IdentifilerTMPlus试剂盒、DNATyperTM19试剂盒和AGCUU17+1试剂盒扩增各自的9947A阳性对照标准物，“GA118-16A”平台均能100%分型，且峰型完整、清晰，分型结果与3130xl平台一致。

试剂盒实际应用测试中，“GA118-16A”平台可达到实际案件检材和建库的检测要求，所得结果分型准确、完整，峰型良好。

综上所述，“GA118-16A型”国产法医遗传分析仪对国内外多种DNA标准物配套使用均具有良好的运行均一性和检测精确度。对标准物配套的试剂盒完全通用，DNA检测结果可靠、准确，灵敏度高，同时，能够满足法医物证实验室建库和案件检验等多重需要。因此，“GA118-16A型”国产法医遗传分析仪性能达到了国外同类产品水平，应用潜力巨大。

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