辣白菜中乳酸菌的分离鉴定

孟令帅，张 颖，邹婷婷，乌日娜,2，岳喜庆，武俊瑞,*

辣白菜中乳酸菌的分离鉴定

孟令帅1，张 颖1，邹婷婷1，乌日娜1,2，岳喜庆1，武俊瑞1,*

（1.沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866；2.江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122）

从沈阳市7 个区25 份朝鲜族家庭制作的传统发酵辣白菜中分离出81 株乳酸菌疑似菌株，初步鉴定34 株为杆菌，47 株为球菌。进一步采用16S rDNA序列分析对81 株菌进行分子鉴定，通过序列分析进行属种鉴定。结果表明：81 株菌均为乳酸菌，分别来自2 个属6 个种，45 株为屎肠球菌，25 株为植物乳杆菌，4 株为干酪乳杆菌，3 株为戊糖乳杆菌，2 株为短乳杆菌，2 株为坚强肠球菌。研究结果为我国东北辣白菜中乳酸菌作进一步研究奠定了基础。

辣白菜；乳酸菌；16S rDNA；同源性分析

辣白菜是韩国、朝鲜和我国东北地区特有的一种传统发酵泡菜食品[1-3]，在我国东北人民饮食中，作为一种非常重要的配菜，至今仍深受消费者喜爱。辣白菜的主要原料是大白菜，其制作方式是：先用盐水将白菜腌制，低温贮存几天，然后，将辣椒、大蒜、生姜、鱼汁、青梅汁和蜂蜜等配料混匀后，均匀地涂抹于白菜的表面，再将一些水果切片涂抹在白菜的表面，最后经过乳酸菌等微生物发酵而成[4-7]。近年来的研究表明，辣白菜中存在丰富的乳酸菌资源[8-9]，是挖掘有益乳酸菌的宝库。2012年，Kim等[10]研究发现，明串珠菌、乳酸杆菌、短乳杆菌以及链球菌有助于泡菜发酵，植物乳杆菌属和片球菌属会使泡菜过度酸化。

本实验试图通过传统方法从采集到的25 份辣白菜样品中分离出乳酸菌疑似菌株，并结合16S rDNA序列分析技术，分别对其鉴定，初步探明辣白菜中乳酸菌的构成。

1 材料与方法

1.1 材料、培养基与试剂

样品分别采自沈阳市大东区、东陵区、皇姑区、和平区、铁西区、于洪区以及苏家屯区7 个区不同的农贸市场，共计25 份辣白菜样品，所用样品均为朝鲜族传统发酵辣白菜。

培养基采用MRS培养基[11]。

20 mg/mL蛋白酶K、RNA酶、正向引物、反向引物、TaKaRa Ex Taq酶、10×PCR Buffer、dNTP Mix、琼脂糖、溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色液北京鼎国昌盛生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅郑州南北仪器设备有限公司；无菌操作台苏净集团安泰公司；DNP-9080生化培养箱上海精密实验设备有限公司；HH-6恒温水浴锅常州国华电器有限公司；VS-1涡旋仪北京鼎昊原料科技有限公司；CR-21G离心机（50 mL）天美科技仪器有限公司；Centrifuge-5418离心机（1.5 mL）上海艾研生物科技有限公司；PTC-200梯度基因扩增仪、琼脂糖凝胶电泳仪美国伯乐公司；UV-3200分光光度计上海美普达仪器有限公司。

1.3 方法

应用层主要是以数据层为基础，通过调用数据层向上提供的接口，对该层提供的盾构运行数据和特征数据进行对应的加工处理，实现相应的业务逻辑，并向表示层提供接口，将实现的业务逻辑通过表示层可视化表现。如此处于系统中间层的应用层是系统核心，起着承上启下的作用，系统的功能实现则主要在这层实现。

1.3.1 辣白菜中乳酸菌活菌数的测定

采用平板计数法，分别对25 个辣白菜样品中的乳酸菌活菌数进行测定[12-13]。

1.3.2 乳酸菌的分离、纯化与初步鉴定

将采集的辣白菜汁样品用灭菌生理盐水进行梯度稀释，分别接种到含有2%碳酸钙的固体MRS培养基中，分别在20、37、45 ℃厌氧培养48 h[14]，挑选有钙圈的菌落，分别划线分离纯化2～3次后，选取单菌落，经革兰氏染色后镜检，同时进行过氧化氢酶实验，确认纯种、革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的无芽孢菌进行拍照保存[11-17]。

1.3.3 乳酸菌16S rDNA序列鉴定

采用十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB）法提取对数生长末期的乳酸菌基因组DNA[18-19]，采用16S rDNA通用引物进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增[20-21]，正向引物为27F（对应于Escherichia coil 8～27位碱基）：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物为1495R（对应于Escherichia coil 1495～1515位碱基）：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′，由上海桑尼生物技术有限公司合成。扩增产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，在1 500 bp处有清晰的条带后测序[22-24]，测序由上海桑尼生物技术有限公司进行。

1.3.4 乳酸菌同源性分析

利用BLAST分析工具（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST）将所分离的乳酸菌16S rDNA序列与GenBank/ EMBL/DDBJ数据库中已知菌株的对应序列进行比较鉴定，寻找与目的基因序列同源性最高的已知菌种[25]。

2 结果与分析

2.1 辣白菜中乳酸菌计数结果

表1 辣白菜中乳酸菌计数结果Table 1 Lactic acid bacterial counts in kimchi

由表1可知，25 个辣白菜样品中乳酸菌菌落总数大约在3.30×108～2.56×1010CFU/mL之间，平均为8.08×109CFU/mL。说明辣白菜样品中乳酸菌含量较高，对于辣白菜的发酵可能发挥着重要的作用。

2.2 辣白菜中乳酸菌的分离与鉴定

2.2.1 辣白菜中乳酸菌的分离与初步鉴定

乳酸菌的形态学特征包括菌落形状、菌落颜色和菌落透明度等，从25 个辣白菜样品中初步分离出81 株疑似乳酸菌的菌株，经过革兰氏染色和过氧化氢酶反应，81 株菌革兰氏染色均为阳性，过氧化氢酶反应均为阴性。其中，革兰氏染色结果为：杆菌34 株，球菌47 株。81 株菌经初步鉴定均为乳酸菌。部分代表型乳酸菌菌株的革兰氏染色镜检照片如图1所示。

图1 部分代表型乳酸菌的革兰氏染色图片Fig.1 Gram staining photos of some representativeLactobacillusstrains

2.2.2 乳酸菌16S rDNA序列鉴定和同源性分析结果

表2 乳酸菌16S rDNA序列同源性分析结果Table 2 Homological analysis of lactic acid bacteria by 16S rDNA sequence

由表2可知，从沈阳各地采集的25 份朝鲜族家庭制作的辣白菜样品中分离到的81 株乳酸菌疑似菌株，经鉴定均为乳酸菌，除菌株20HM1-2、37TX2-2、37HX2-1、37SJ1-6、20HX3-1和37HX7-1这6 株菌外，其余75 株菌与标准菌株的同源性均在99%以上，其中，56 株菌与标准菌株的同源性达到100%。将上述结果进行归纳后可得到表3。

表3 辣白菜中乳酸菌的分布结果Table 3 Distribution of lactic acid bacteria in kimchi

由表3可知，25 份样品中分离出的81 株乳酸菌疑似菌株，经16S rDNA序列测定和同源性分析鉴定，分属2 个属6 个种，分别为E. faecium 45 株，占分离菌株总数的55.6%；L. plantarum 25 株，占分离菌株总数的30.86%；L. casei 4 株，占分离菌株总数的4.94%；L. pentosus 3 株，占分离菌株总数的3.70%；L. brevis 2 株，占分离菌株总数的2.5%；E. durans 2 株，占分离菌株总数的2.5%。E. faecium和L. plantarum是本次分离菌株中数量最多的菌种，同时大多数样品中均分离出了这两种乳酸菌，因此，可以推断L. plantarum和E. faecium是本次采集的25 份辣白菜样品中的乳酸菌优势菌种。

2.2.3 辣白菜中乳酸菌的分离温度分布分析

从沈阳25 份辣白菜样品中共分离出81 株乳酸菌，结合表2对这81株乳酸菌的分离温度进行了对比，结果见表4。

表4 辣白菜中乳酸菌的分离温度分布结果Table 4 Temperature distribution of lactic acid bacteria in kimchi

由表4可知，20 ℃培养条件下共分离出24 株乳酸菌，占所分离乳酸菌菌株总数的29.63%；37 ℃培养条件下共分离出42 株乳酸菌，占所分离乳酸菌菌株总数的51.85%；45 ℃培养条件下共分离出15 株乳酸菌，占所分离乳酸菌菌株总数的18.52%。不同属种乳酸菌有着不同的最适生长温度，本次采集的辣白菜样品中的乳酸菌大多数最适生长温度在37 ℃左右。而在20、37、45 ℃培养条件下均分离到了L. plantarum和E. faecium这两种菌，说明这两种菌对温度的适应范围比较广，并且对温度的耐受性较强，属于辣白菜样品中的乳酸菌优势菌种。属于低温型菌种的L. brevis只在20 ℃培养条件下分离得到。属于中低温型菌种的L. casei和L. pentosus则在20 ℃和37 ℃培养条件下分离到。由此可知，在不同培养温度下，分离得到的菌群有一定差异，同一类群菌株在不同温度培养条件下生长情况也不相同，以上结果可为以后乳酸菌的分离鉴定提供参考。

3 结论与讨论

国外对韩国泡菜做了较多研究，研究发现其中蕴含着丰富的乳酸菌资源。而国内对于四川泡菜的研究较多，主要集中于对四川泡菜中乳酸菌多样性分析、特定功能乳酸菌的筛选等，国内外学者均成功从泡菜中分离鉴定出了不同种类的乳酸菌，表明乳酸菌是自然发酵泡菜中的优势菌群，并在其发酵过程中起着重要作用。同时不同地区和生存环境采集的样品中，微生物种类、群落结构和生物学特性均有差异。我国东北居住着大量朝鲜族居民，至今仍保留着采用传统方法制作和食用辣白菜等自然发酵泡菜食品的习惯，再加上我国东北特有的地理、气候和环境特点，我国东北辣白菜现已成为我国一种独特的传统发酵泡菜制品。通过采集沈阳25 份辣白菜样品，并从中分离鉴定出81 株乳酸菌。其中不但分离到了L. plantarum、L. brevis、L. pentosus、L. casei以及E. faecium等国内外泡菜研究中发现的常见菌种，同时也分离到了2株E. durans，这是其他文献中鲜有报道的。

我国东北传统发酵辣白菜中蕴含着丰富多样的乳酸菌资源，是我国乳酸菌研究和资源开发的一个宝库。与国内外类似发酵泡菜食品相比，我国东北辣白菜中的乳酸菌种类、分布和组成又有独特的地区地域特点，可进一步从中挖掘和开发一些新的或特有的乳酸菌优良菌株。

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Isolation and Identification of Lactic Acid Bacteria from Kimchi

MENG Lingshuai1, ZHANG Ying1, ZOU Tingting1, WU Rina1,2, YUE Xiqing1, WU Junrui1,*
(1. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 2. State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Lactic acid bacteria were isolated and identified from 25 Korean traditional fermented kimchi samples from 7 districts of Shenyang. Totally 81 strains suspected of being lactic acid bacteria were isolated successfully, and 34 of the isolated strains were identifi ed as bacilli and 47 were identifi ed as cocci. These 81 strains were further identifi ed by 16S rDNA sequence analysis. The results showed that all these 81 strains were confi rmed as lactic acid bacteria from 2 genus and 6 species, including 45 strains of Enterococcus faecium, 25 strains of Lactobacillus plantarum, 4 strains of Lactobacillus casei, 3 strains of Lactobacillus pentosus, 2 strains of Lactobacillus brevis, and 2 strains of Enterococcus durans. These results can provide a basis for further studies on lactic acid bacteria from kimchi in northeast China.

kimchi; Lactobacillus; 16S rDNA; homology analysis

TS201.3

A

10.7506/spkx1002-6630-201511025

2014-11-25

国家自然科学基金面上项目（31470538；31370502）；中国博士后科学基金资助项目（2014M560395）；

辽宁省农业领域青年科技创新人才培养资助计划项目（2014048）；江苏省博士后科研资助计划项目（1402071C）；沈阳农业大学“天柱山英才支持计划”项目

孟令帅（1989—），男，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：15040260380@163.com

*通信作者：武俊瑞（1977—），男，副教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：junruiwu@126.com