沙棘籽渣酶解产物的体内外抑菌作用

陈 彤，王常青*，连伟帅，宁庆鹏，白云云，李小凡，郝志萍

沙棘籽渣酶解产物的体内外抑菌作用

陈 彤，王常青*，连伟帅，宁庆鹏，白云云，李小凡，郝志萍

（山西大学生命科学学院，山西 太原 030006）

以沙棘籽渣为原料，采用水提法提取沙棘籽渣蛋白，再用ProteAX复合蛋白酶和胃蛋白酶两种酶酶解，利用膜过滤对其分离纯化，得到具有抑菌活性的沙棘籽渣蛋白酶解物。体外实验结果表明：ProteAX复合蛋白酶水解多肽对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、绿脓杆菌均有抑制作用，胃蛋白酶水解多肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌有抑制作用。动物实验表明：胃蛋白酶水解多肽灌胃的小鼠粪便中，沙门氏菌的菌落总数与阳性对照组相比显著减少（P＜0.05）；而灌胃ProteAX复合蛋白酶水解多肽的小鼠粪便中，金黄色葡萄球菌的菌落总数比阳性对照组显著降低（P＜0.05）。

沙棘籽渣酶解物；抑菌作用；体内外实验

沙棘是一种珍贵的药食两用作物，其中含有VA、VC、VE等多种维生素，还有丰富的黄酮类、原花青素等生物活性物质[1]。沙棘籽渣是沙棘榨油后的工业废物，常用作动物饲料[2]，但其中的蛋白利用率很低。经测定，沙棘籽渣中含有25%～30%的蛋白质[3]，如果能够将这些蛋白质有效地水解加工成小分子的多肽，不但可以大大提高利用率，而且还有许多保健作用。近年来，国内外市场上的沙棘提取物主要为沙棘籽油、沙棘果油、沙棘果粉、原花青素、沙棘黄酮、沙棘膳食纤维等[4-6]，关于沙棘籽渣多肽的研究较少，对其功能性研究更少[7-9]，尚未见到关于沙棘籽渣抗菌肽方面的研究。本实验以脱脂沙棘籽渣为原料，采用蛋白酶水解制备沙棘籽渣抗菌多肽，并对其体内外抑菌作用进行研究，旨在为能够充分利用沙棘蛋白资源，开发出天然植物源的抑菌剂开辟一条新途径。

1 材料与方法

1.1材料、动物与试剂

沙棘籽渣为二氧化碳超临界提油后的残渣，粗蛋白含量26.25%，山西五台山沙棘制品有限公司提供；金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、绿脓杆菌 中科院微生物研究所。

胃蛋白酶（酶活力3 000 U/g）广西庞博生物工程有限公司；ProteAX复合蛋白酶（酶活力24 000 U/g）日本天野酶制品株式会社。

清洁级雄性昆明小鼠，体质量20～25 g，山西医科大学动物实验中心提供，动物生产合格证号为SCXK（晋）2009-0001，动物使用合格证号为SCXK（晋）2009-0004。

金黄色葡萄球菌试纸片、沙门氏菌试纸片广州绿洲科技股份有限公司；沙门氏菌显色培养基、营养琼脂培养基、杆菌肽北京奥博星生物技术有限公司；其余化学试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

Sephadex凝胶色谱系统、UVD-680-3紫外检测仪上海金达生物科技有限公司；SP-2012UVPC紫外分光光度计上海光谱仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1沙棘籽渣酶解产物的制备

沙棘籽渣经粉碎、过筛和去杂等预处理后，以料液比1∶15（m/V）加水，浸泡过夜，在前期实验摸索出的蛋白酶最佳条件下加入蛋白酶水解[10-12]。胃蛋白酶的酶解条件：温度40℃、pH 2.5、水解时间3 h、加酶量3 000 U/g；ProteAX复合蛋白酶的酶解条件：温度50℃、pH 6.5、水解时间4 h、加酶量3 000 U/g。水解多肽灭酶后经微滤和孔径为5 000 D的超滤膜超滤以除去大分子杂质，经孔径为500 D的纳滤膜纳滤以除去大部分盐分、原花青素、黄酮等小分子杂质，得到实验用多肽，经测定蛋白质纯度分别为78.44%和82.72%。

1.3.2多肽得率及分子质量测定

多肽含量采用QB/T 2879—2007《海洋鱼低聚肽粉》中的三氯乙酸沉淀法测定，按照下式计算多肽得率。

多肽分子质量的测定采用Sephadex G-25凝胶色谱法[13]，测检波长为220 nm。制作标准曲线的Marker为胸腺肽（3 108 D）、杆菌肽（1 486 D）和还原性谷胱甘肽（307 D）。以Marker的分子质量对数值（lgM）为横坐标，洗脱体积（Ve）为纵坐标制作标准曲线，方程为Ve=-30.55 lgM+192.12。用峰面积归一法计算出多肽水解液的分子质量分布范围。

1.3.3体外抑菌实验

选大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及绿脓杆菌，以质量浓度为20 mg/mL的沙棘籽渣酶解物进行抑菌圈实验，采用平板打孔法，操作步骤参照文献[14]：每个孔内加入20 μL的待检物，设无菌水为空白对照组，1 mg/mL的杆菌肽溶液作为阳性对照组，培养皿在37℃培养48 h，测量各抑菌圈的直径，抑菌圈的直径比空白对照组明显增大，则表示该沙棘籽渣多肽有抑菌作用。

1.3.4菌悬液浓度曲线及最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）测定

将已活化的金黄色葡萄球菌及沙门氏菌用无菌生理盐水配制成菌悬液，将该液适当稀释后在显微镜下用血球计数板计数[15]，取同一菌悬液，配制稀释2、4、8、16、32、64倍的系列标样，在600 nm波长处以比色皿比浊，以无菌水为参比，分别测定其吸光度A600nm；以血球计数板所测的菌体含量的对数值为横坐标，其对应的系列标样吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

采用二倍稀释法验证沙棘籽渣酶解物的抑菌作用，并测定沙棘籽渣酶解物的MIC[16]，即取10支无菌试管编号，1～8号为沙棘籽渣酶解物质量浓度为160、80、40、20、10、5、2.5、1.25 mg/mL的含菌（菌浓度为108CFU/mL）稀释液；9号为取1 mL菌悬液，不加实验药物的菌液对照管；10号管为取1 mL沙棘籽渣多肽，不加菌悬液的药物对照管，摇匀后于37℃培养24 h后观察结果。判定标准为首先观察9号菌液对照管细菌呈混浊状生长，而10号药物对照管无细菌生长呈透明状的前提下，以不出现混浊的最低沙棘籽渣多肽质量浓度为其MIC。

1.3.5体内抑菌实验

将复苏生长良好的筛选菌种分别配成108CFU/mL菌悬液，取清洁级昆明小鼠70只，随机分为7组，每组10只[17-23]。A组为正常对照组，灌胃无菌生理盐水0.5 mL/d；B、C、D组每只小鼠灌胃金黄色葡萄球菌菌悬液0.5 mL/d；E、F、G组每只小鼠灌胃沙门氏菌菌悬液0.5 mL/d；感染第7天对所有小鼠的粪便进行细菌培养，确认模型复制成功后，B、E为阳性对照组，每只小鼠每天灌胃1 mg/mL的杆菌肽溶液（多肽类抗生素）0.5 mL；C、D组分别为ProteAX复合蛋白酶水解多肽低、高剂量组，分别给予每只小鼠每天灌胃20、160 mg/mL的ProteAX复合蛋白酶水解多肽0.5 mL（相当于0.34、2.7 g/（kg·d），下同）；F、G组分别为胃蛋白酶水解多肽低、高剂量组，分别给予每只小鼠每天灌胃20、160 mg/mL的胃蛋白酶水解液0.5 mL；以粪便细菌培养菌落总数为评价指标，比较各组与阳性对照组的差异。

1.4数据统计分析

实验数据用SPSS 18.0软件统计处理，实验结果以±s表示，用t检验进行统计分析。

2 结果与分析

2.1酶解产物得率及多肽分子质量分析

图1 ProteAX复合蛋白酶（A）、胃蛋白酶（B）水解多肽的G-25凝胶色谱图Fig.1 Sephadex G-25 profiles of enzymatic hydrolysates of sea buckthorn seed residue with ProteAX protease (A) and pepsin (B)

表1 两种沙棘籽渣酶解产物的主要成分及含量Table 1 Contents of main constituents in two enzymatic hydrolysates of sea buckthorn seed residue

由图1、表1可知，ProteAX复合蛋白酶酶解产物得率和水解液中多肽含量比胃蛋白酶酶解产物高12.64%和0.19%。两种酶水解多肽分子质量分布也有差异，其中ProteAX复合蛋白酶水解多肽在＜1 000 D的分子质量比例比胃蛋白酶水解多肽高8.57%；而胃蛋白酶水解多肽在1 000～5 000 D和＞5 000 D分子段的百分率比ProteAX复合蛋白酶水解多肽高5.66%和2.91%。根据沙棘籽渣酶解产物的分子质量分布，猜测沙棘籽渣酶解产物中起抑菌活性的成分可能为＜1 000 D的短肽。

2.2体外抑菌实验结果

表2 沙棘籽渣酶解物的体外抑菌实验Table 2 Antibacterial activityin viittrrooof two enzymatic hydrolysates of sea buckthorn seed residue

图2 沙棘籽渣酶解物的体外抑菌圈Fig.2 Bacteriostasisin vitroof two enzymatic hydrolysates of sea buckthorn seed residue

由表2可知，ProteAX复合酶水解多肽对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、绿脓杆菌都具有抑菌作用，且对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强（图2A）。胃蛋白酶水解多肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌都具有抑菌作用，且对沙门氏菌抑菌作用最强（图2B）。为进一步进行体内抑菌实验，测定ProteAX复合酶水解多肽对金黄色葡萄球菌菌悬液的MIC、胃蛋白酶水解多肽对沙门氏菌菌悬液的MIC，验证这两种沙棘籽渣酶解物的抑菌作用。

2.3菌悬液含量标准曲线方程

以所测的菌体含量为横坐标，其对应的系列标样吸光度为纵坐标，得到金黄色葡萄球菌的标准曲线方程为y=1.545 9x-11.994（R2=0.983 7）；沙门氏菌的标准曲线方程为y=1.612 5x-12.679（R2=0.991 2）。该线性回归方程可用于测定菌悬液含量。

2.4最低抑菌浓度测定结果

表3 沙棘籽渣酶解物的MICTble 3 MIC of enzyymatic hydrolysates of sea bucckthorn seed residue

由表3可知，ProteAX复合蛋白酶酶解物的抑菌作用要优于胃蛋白酶，且对金黄色葡萄球菌的MIC为10 mg/mL，而胃蛋白酶酶解物对沙门氏菌的MIC为20 mg/mL，故选用20 mg/mL的两种多肽水解液作为体内抑菌实验的低剂量组。

2.5体内抑菌实验结果

小鼠感染金黄色葡萄球菌及沙门氏菌模型成功建立后，灌胃不同种类及剂量沙棘籽渣酶解产物，在不同时间采取新鲜粪便进行细菌计数及统计学分析，结果见表4。

表4 沙棘籽渣酶解物的体内抑菌实验结果Table 4 Antibacterial activity in viivvooof enzymatic hydrolysates of sea buckthorn seed residue

由表4可知，对于金黄色葡萄球菌组，灌胃ProteAX复合蛋白酶水解多肽的高剂量组小鼠染菌3、7、9、12、14 d后，粪便内金黄色葡萄球菌的菌落总数显著低于阳性对照组，而低剂量组与阳性对照组相比，灌胃12、14 d后才有明显差异，说明ProteAX复合蛋白酶水解多肽在2.7 g/（kg·d）剂量下有较强的体内抑菌作用。对于沙门氏菌组，灌胃高剂量胃蛋白酶水解多肽的小鼠染菌7、9、12、14 d后，粪便内沙门氏菌数的菌落总显著低于阳性对照组，而低剂量组在灌胃9、12 d后才显著低于阳性对照组，这说明胃蛋白酶水解多肽在0.34 g/（kg·d）剂量下对沙门氏菌的生长有一定的抑制作用，在2.7 g/（kg·d）剂量下抑制效果更好。

3 结 论

本实验以ProteAX复合蛋白酶及胃蛋白酶对沙棘籽渣水提蛋白进行酶解，得到两种有抑菌活性的酶解物。通过体内外抑菌实验表明，其均对常见肠道致病菌有明显的抑菌效果。ProteAX复合蛋白酶水解沙棘籽渣的酶解产物对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、绿脓杆菌均有抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌的最低抑菌质量浓度为10 mg/mL，而胃蛋白酶水解多肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌有抑制作用，其中对沙门氏菌的最低抑菌质量浓度为20 mg/mL。动物实验结果表明，灌胃胃蛋白酶水解多肽的鼠粪中沙门氏菌的含菌量比阳性组显著减少（P＜0.05），而灌胃ProteAX复合蛋白酶水解多肽的鼠粪中金黄色葡萄球菌含菌量显著降低（P＜0.05），故两种酶解物均可被进一步开发，应用于食品防腐保鲜中。

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Antibacterial Activity in vivo and in vitro of Enzymatic Hydrolysates of Sea Buckthorn Seed Residue

CHEN Tong, WANG Changqing*, LIAN Weishuai, NING Qingpeng, BAI Yunyun, LI Xiaofan, HAO Zhiping (College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

In this work, we obtained antibacterial peptides by enzymatic hydrolysis of water-soluble proteins from the residue left after supercritical carbon dioxide extraction of seed oil from sea buckthorn seeds with ProteAX protease and pepsin respectively and purifi cation of the resultant hydrolysates by membrane fi ltration. in vitro test results indicated that the ProteAX hydrolysate possessed bacteriostasis on Staphylococcus aureus, Salmonella, and Pseudomonas aeruginosa, while the pepsin hydrolysate possessed bacteriostasis on Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Salmonella. Animal test results showed that the count of Salmonella in the feces of mice administered by gavage with the pepsin hydrolysate was signifi cantly reduced (P < 0.05) when compared with the positive group, whereas the count of Staphylococcus aureus in the feces of mice orally administered with the ProteAX hydrolysate was signifi cantly lower (P < 0.05) when compared with the positive group.

enzymatic hydrolysate of sea buckthorn seed residue; bacteriostatic activity; in vivo and in vitro test

X792

A

10.7506/spkx1002-6630-201511018

2014-09-01

陈彤（1992—），女，硕士研究生，研究方向为功能性食品开发。E-mail：chentong0307@163.com

*通信作者：王常青（1956—），男，教授，本科，研究方向为食品生物技术与功能食品的开发。E-mail：wcq@sxu.edu.cn