马铃薯渣中淀粉组分抵抗α-淀粉酶降解的机制

张献梅，程 力,2,*，洪 雁,2，顾正彪,2，李兆丰,2

马铃薯渣中淀粉组分抵抗α-淀粉酶降解的机制

张献梅1，程 力1,2,*，洪 雁1,2，顾正彪1,2，李兆丰1,2

（1.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；2.江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，食品安全与营养协 同 创新中心，江苏 无锡 214122）

从淀粉组分自身的性质以及其他组分对淀粉糊化、酶解作用的影响出发，研究马铃薯渣中淀粉组分抵抗α-淀粉酶降解的机制。对马铃薯渣中提取淀粉的性质研究表明：马铃薯渣中的淀粉和普通马铃薯淀粉具有相似的结构性质，其自身并不抵抗酶解。通过对马铃薯渣中其他组分对淀粉渗透、糊化影响的研究表明：其他组分对马铃薯渣中淀粉组分的包裹、阻隔作用使淀粉糊化以及和酶的作用受到阻碍，是影响淀粉酶解的主要因素。通过酶法预处理去除果胶、纤维素后对淀粉酶解效果的研究表明：去除果胶和纤维素后可解除其他组分对淀粉酶解的阻碍，且果胶对淀粉酶解的阻碍作用较大，纤维素次之。分别去除果胶、纤维素和同时去除两种组分，可使所制备的马铃薯渣膳食纤维中淀粉的残存量 由原来的20.63%分别降低到5.67%、15.70%和1.28%。

马铃薯渣；淀粉；抵抗酶解；纤维素；果胶

我国是世界上最大的马铃薯种植国，随着我国马铃薯淀粉行业的发展，每年有大量的马铃薯被加工成淀粉，同时产生上百万吨的湿薯渣。马铃薯渣是一种富含多种营养物的混合物，但湿渣中水分含量高且含有大量的微生物，极易腐败变质，造成环境污染[1]。因此，开发一种湿马铃薯渣的有效综合利用方式，对马铃薯淀粉行业的发展和解决日益严峻的环境问题都具有重要的价值。

马铃薯渣中膳食纤维含量高达50%～60%，其中可溶性膳食纤维占14%～15%[2]，是一种高品质的膳食纤维原料。膳食纤维的生理功效是明显而肯定的，包括预防便秘与结肠癌、调节血脂、调节血糖以及减肥等。随着人们对健康的关注程度越来越高，膳食纤维的需求量也越来越大[3]。因此，以马铃薯渣为原料制备膳食纤维将成为马铃薯渣开发利用的一种有效方式。

王卓等[2]采用α-淀粉酶去除马铃薯渣中淀粉组分制备马铃薯渣膳食纤维（potato pulp dietary fi ber，PDF），但产品PDF中淀粉 残存量高达25%～26%。Thomassen等[4]采用耐热α-淀粉酶去除湿马铃薯渣中淀粉组分，淀粉最高去除率为21%～22%，残存量也高达20%～22%，采用AOAC 985.29《食物中总膳食纤维 酶-重量法》测定膳食纤维的方法去除淀粉，去除率为23.2%，残存量也高达21%。与马铃薯渣膳食纤维相比，小麦麸皮膳食纤维中淀粉残存量仅为5.7%[5]，玉米皮和米糠膳食纤维中淀粉残存量均小于3%[6-7]。马铃薯渣中淀粉组分表现出了抵抗α-淀粉酶降解的性质，淀粉难以被酶解，过高的淀粉残存量影响了PDF的品质，限制了其应用，也导致以马铃薯渣为原料制备膳食纤维的综合利用技术无法得到推广和应用。

本实验以湿马铃薯渣中的淀粉组分为研究对象，从马铃薯渣中淀粉组分自身的性质和其他组分对淀粉糊化、酶解作用的影响出发，研究其抵抗α-淀粉酶降解的机制，确定马铃薯渣膳食纤维制备过程中抑制淀粉酶解的主要因素，为以马铃薯渣为原料制备高品质膳食纤维提供理论参考和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

湿马铃薯渣由内蒙古奈伦集团提供。

α-高温淀粉酶（酶活力20 000 U/mL） 无锡杰能科生物工程有限公司；果胶酶（酶活力3 800 U/mL）、纤维素酶（酶活力700 U/mL） 美国Sigma-Aldrich集团；其他试剂均为分析纯 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SHZ-B水浴恒温振荡器 上海博泰实验设备有限公司；WFJ2000分光光度计 上海尤尼柯公司；Pyris 1型差示扫描量热仪 美国PE公司；D8 Advance型X衍射分析仪 德国Bruker AXS公司；Nicolet iS10傅里叶变换红外光谱仪 美国Thermo Scientifi c公司；LC-20AT型高效液相色谱仪 日本岛津公司；OLYMPUS-BX41热台光学显微镜 日本奥林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 马铃薯渣中淀粉组分的提取

参照李涛等[8]的水酶法提取青稞淀粉工艺研究，将马铃薯渣中淀粉的提取工艺修改确定如下：马铃薯渣→纤维素酶、果胶酶处理（样品-水（1∶10，m/V），pH 4.8，50 ℃，4 h）→过筛→离心→洗涤→40 ℃烘干。

1.3.2 α-高温淀粉酶酶解效果测定[9]

分别准确称量1 g自提马铃薯渣淀粉、普通马铃薯淀粉（精确到0.1 mg），按样品与磷酸盐缓冲液（pH 6.0）1∶5（m/V）加入缓冲液，摇匀，加入150 U/g α-高温淀粉酶，160 r/min、95 ℃在水浴恒温振荡器中反应30 min。酶水解产物经4 500 r/min离心10 min得到酶水解液，3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法测定水解液中还原糖含量[10]，计算α-高温淀粉酶酶解率。酶解率计算公式如下[11]。

式中：m0为还原糖质量/g；m为淀粉质量/g；C为淀粉水分含量/%。

1.3.3 结晶结构分析

自提马铃薯渣淀粉、普通马铃薯淀粉研磨过100 目筛后，采用X射线衍射仪（X-ray diffractometer，XRD）观察其晶体结构。测试条件如下：衍射角（2θ）以4 °/min的扫描速率从4 °升到40 °。X射线衍射图谱通过MDI Jade 5.0软件进行分析[12]。

1.3.4 热力学特性分析

采用差示扫描量热仪（differential scanning calorimetry，DSC）分别对自提马铃薯渣淀粉、普通马铃薯淀粉的热力学特性进行测试。分别准确称量1.0 mg上述两种样品（精确到0.1 mg），按样品-水（1∶2，m/m），加入去离子水并混合均匀。以空皿为参比，扫描温度从20 ℃到100 ℃，扫描速率为10 ℃/min[12]。

1.3.5 马铃薯渣中淀粉组分糊化过程中淀粉渗透量的测定[13]

样品制备：准确称量一定量的湿马铃薯渣和自提马铃薯渣淀粉，加水至淀粉质量分数为6%（以干质量计），置于三角瓶中，于指定温度（50、60、70、80、90、100 ℃）水浴恒温振荡器中糊化30 min，转速为 200 r/min。取出后立即转移至离心管，以6 000 r/min离心 30 min，取上清液备用。

测定方法：称取100 mg马铃薯直链淀粉于三角瓶内，加入1 mol/L的NaOH 9 mL，95%的乙醇1 mL，随后在沸水浴中加热15 min，冷却后以蒸馏水转移至100 mL容量瓶内，并定容至刻度。吸取上述溶液2.5 mL于50 mL棕色容量瓶中，加入1 mol/L HCl 0.5 mL及碘液1 mL，用蒸馏水定量至刻度，避光静置20 min，在 620 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线；以相同的方法测定样品上清液，计算淀粉渗透量。淀粉渗透量的计算公式如下。

式中：m1为渗透出的淀粉质量/mg；m为样品中淀粉质量/g；C为样品水分含量/%。

1.3.6 马铃薯渣中淀粉组分糊化过程颗粒形貌分析

配制马铃薯渣淀粉悬浊液（质量分数1%）与马铃薯渣混合液（淀粉组分质量分数约1%），将制备好的样品置于热台中，用硅胶黏合剂密封，以防止水分在加热过程中的挥发，并以2 ℃/min的升温速率加热到100 ℃，光学显微镜（10×50）下观察，并采集图象[14]。

1.3.7 马铃薯渣中果胶、纤维素和淀粉之间的氢键作用分析

样品制备：称取一定质量的湿马铃薯渣5 份，按样品-磷酸盐缓冲液（pH 4.8）1∶5（m/V）加入缓冲液，摇匀；分别加入40 U/g果胶酶（2 份）、50 U/g纤维素酶（2 份）和40 U/g果胶酶-50 U/g纤维素酶混合酶（1 份），在50 ℃水浴恒温振荡器中160 r/min分别反应1、4、4 h，即分别去除马铃薯渣中的果胶、纤维素、果胶和纤维素。向果胶酶和纤维素酶处理过的样品中（其中1 份）加入1 mol/L NaOH调解pH值至6.0，加入150 U/g α-高温淀粉酶，95 ℃在水浴恒温振荡器中160 r/min反应30 min，即分别去除马铃薯渣中的果胶和淀粉、纤维素和淀粉。酶水解后真空抽滤、滤渣冷冻干燥[15]，制备出主要成分分别为纤维素/淀粉、果胶/淀粉、淀粉、纤维素、果胶的样品。

测定方法：取适量的溴化钾和样品，研磨充分，压片法制备薄片，使用傅里叶红外光谱仪测试。条件如下：以空气为参比 ，扫描波数范围为4 000～500 cm-1，扫描次数为32 次，通过Omnic8.0软件分析结果[12]。

1.3.8 酶法预处理后马铃薯渣中淀粉组分的酶解效果分析

预处理方法：称取一定质量的湿马铃薯渣，按样品-磷酸盐缓冲液（pH 4.8）1∶5（m/V）加入缓冲液，摇匀；分别加入40 U/g果胶酶、50 U/g纤维素酶和40 U/g果胶酶-50 U/g纤维素酶混合酶，在50 ℃水浴恒温振荡器中160 r/min反应1、4、4 h[15]。即分别去除马铃薯渣中的果胶、纤维素、果胶和纤维素，酶解结束后，沸水浴15 min灭酶。

α-高温淀粉酶酶解：取预处理后的马铃薯渣，1 mol/L NaOH调节pH值至6.0，加入150 U/g α-高温淀粉酶，在95 ℃水浴恒温振荡器中160 r/min反应30 min。酶水解产物经4 500 r/min离心10 min，移除上清液，测定残渣中淀粉残存量，淀粉含量测定方法参照GB/T 5009.9—2008《食品中淀粉的测定》。用淀粉残存量表征马铃薯渣中淀粉组分的酶解效果。

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 马铃薯渣中淀粉组分理化性质的研究

抗性淀粉具有抵抗α-淀粉酶降解的特性。Xu Shasha等[16]通过XRD、DSC研究了抗性淀粉的微观结构、结晶结构和热力学性质，曹力心[17]研究了马铃薯渣抗性淀粉的抗酶解性，结果表明抗性淀粉在这些理化性质方面和普通淀粉存在显著差异，结晶结构的变化和淀粉颗粒的完整性是影响淀粉酶解特性的主要因素。本实验将马铃薯渣中的淀粉单独提取出来，对其理化性质进行分析[18]，研究淀粉组分自身是否抵抗酶解。

2.1.1 α-高温淀粉酶酶解效果分析

表1 马铃薯渣淀粉和马铃薯淀粉酶解率Table 1 Hydrolysis rates of potato pulp starch and potato starch

单独对自提马铃薯渣淀粉和普通马铃薯淀粉进行酶解分析，结果如表1所示，两种淀粉的酶解率不存在显著性差异（P＞0.05）；且还原糖含量均在60%以上，而马铃薯抗性淀粉采用耐高温α-淀粉酶95 ℃酶解24 h，还原糖含量仅为2.1%[17]，明显低于马铃薯渣淀粉经酶解后的还原糖含量；可以判定马铃薯渣淀粉自身不抵抗酶 解。

2.1.2 结晶结构分析结果

图1 自提马铃薯渣淀粉和普通马铃薯淀粉的X射线衍射图Fig.1 X-ray diffraction patterns of potato pulp starch and potato starch

变性淀粉抵抗酶解的一个主要原因是淀粉的结晶结构加固、结晶度增大[16]。由图1可知，自提马铃薯渣淀粉和普通马铃薯淀粉均呈现尖峰衍射和弥散衍射特征，可见两种淀粉颗粒均由结晶区和非结晶区两部分组成，属于多晶体系，在2θ为5.6 °、15 °、17.2 °、19.5 °、22.2 °、24 °处出现了明显的尖峰衍射，都属于典型的B型晶体结构。且自提马铃薯渣淀粉和普通马铃薯淀粉具有相近的结晶度，分别为32.06%和31.87%，不存在显著性差异（P＞0.05）。综合分析自提马铃 薯渣淀粉与普通马铃薯淀粉的晶体结构与结晶度，均没有明显差别，这与自提马铃薯渣淀粉不抵抗酶解的结果一致。

2.1.3 热力学特性分析结果

淀粉糊化是一个一级相变过程，差示扫描量热法可用于测定淀粉发生糊化的相转变温度（T0、TP）、转换温度范围（TC-T0）和所需的吸热焓（ΔH）。其中，ΔH主要代表了淀粉相变过程中双螺旋结构的解聚及熔融所需的能量，从而反映出淀粉的糊 化度[19]。淀粉结晶区周围的无定形区会影响T0、TP、TC的变化，主要反映了淀粉的结构和结晶度，TC-T0反映淀粉内部的结晶体完善程度、晶体大小差异情况，TC-T0越大，说明淀粉内部结晶体的差异程度越大[20]。

表2 自提马铃薯淀粉与普通马铃薯渣淀粉热力学参数Table 2 DSC thermal characteristics of potato starch and potato pulp sttaarrcchh

表2显示了自提马铃薯渣淀粉和普通马铃薯淀粉的热力学特性参数，统计分析表明自提马铃薯渣淀粉的吸热峰没有明显变宽，T0、TP、TC、ΔH均没有明显增加。自提马铃薯渣淀粉和普通马铃薯淀粉表现出了相近的热力学性质，具有相近的糊化性质和结晶性质。

综合比较自提马铃薯渣淀粉与普通马铃薯淀粉的酶解效果、结晶特性、热力学特性，表明自提马铃薯渣淀粉组分在形态结构及酶解特性方面均和普通马铃薯淀粉没有显著差异。说明自提马铃薯渣淀粉组分本身不具有抵抗酶解的性质，淀粉难以被酶解的原因可能是底物复杂的组成，果胶、纤维素等组分阻碍了淀粉的酶解。

2.2 马铃薯渣中其他组分对淀粉组分理化性质的影响

2.2.1 马铃薯渣中其他组分对淀粉组分糊化过程中淀粉渗透量的影响

淀粉可溶性组分在糊化过程中的渗透量可以反映淀粉糊化的难易程度[13]。马铃薯渣中淀粉可溶性组分在糊化过程中的溶出会受到其他非淀粉组分的影响。

图2 马铃薯渣中其他组分对淀粉渗透量的影响Fig.2 Effects of other componen ts on the amount of starch polymer molecules leaching in potato pulp

由图2可知，对单独的自提马铃薯渣淀粉而言，淀粉可溶性组分的渗透量随着温度的升 高而增大，其中，在70～100 ℃温度范围内显著增加。70～80 ℃范围内淀粉渗透量升高主要是由于淀粉分子摄取大量水分、迅速膨胀，结晶结构被破坏，导致大量淀粉可溶性组分溶出。80～100 ℃范围内淀粉渗透量升高是由于进一步的水化与加热使得淀粉颗粒结构内的支链淀粉双螺旋解聚，淀粉的刚性丧失，颗粒轮廓逐渐消失，淀粉可溶性组分进一步渗透出来[13]。与单独的自提马铃薯渣淀粉相比，马铃薯渣体系中每克淀粉中淀粉渗透量较低，且与单独淀粉不同，马铃薯渣体系中淀粉渗透量在80～100 ℃温度范围内的增加较为显著，说明马铃薯渣体系中其他组分对淀粉的溶出、渗透有阻碍作用。可能是纤维素、果胶组分与淀粉颗粒之间存在缠绕、包裹，影响淀粉颗粒与水的接触、阻碍淀粉的渗透，影响了淀粉的糊化。

2.2.2 马铃薯渣中其他组分对淀粉组分糊化的影响

图3 自提马铃薯渣淀粉分子糊化过程光学显微镜图（×50000）Fig.3 Microscopic images for the gelatinization process of potato pulp starch molecules (×500)

图4 湿马铃薯渣中淀粉分子糊化过程光学显微镜图（×50000）Fig.4 Microscopic images for the gelatinization process of starch in wet potato pulp (×500)

用热台光学显微镜连续观察同一视野内自提马铃薯渣淀粉和湿马铃薯渣中淀粉的糊化过程。由图3可知，60～65 ℃时，已有少量淀粉分子吸水润胀，温度升高到68 ℃，淀粉分子在水和热的作用下迅速膨胀，继续升温到70～80 ℃，淀粉分子继续膨胀并伴随着结构崩解，使得淀粉颗粒逐渐失去原形，只剩下最外层的一个不成形的空囊，90 ℃以上淀粉分子的轮廓已基本消失，完全糊化。由图4可知，温度低于65 ℃时，湿马铃薯渣中淀粉基本保持淀粉分子的完整性，温度升高到65～70 ℃，淀粉分子刚开始出现少量吸水润胀，继续升温到72～85 ℃，淀粉分子在水和热的作用下才迅速膨胀，但仍保持淀粉颗粒的原形，直至升温到100 ℃，大量的淀粉分子仍未发生崩解，糊化不彻底。对比图3和图4可知，马铃薯渣中其他组分对淀粉的膨胀糊化存在明显的抑制作用，导致淀粉难以糊化。可能是马铃薯渣中的主要成分纤维素和果胶包裹、缠绕在淀粉周围，并且在糊化过程中能够束缚体系中水分子的移动，使参与糊化的水分子减少，造成淀粉不能充分吸水膨胀[21]。结合图2～4推测果胶和纤维素是阻碍淀粉组分酶解的主要因素。

2.2.3 马铃薯渣中纤维素、果胶与淀粉组分之间的氢键作用

由图5可知，马铃薯渣中各组分在3 742～3 002 cm-1处都有一个较宽且吸收较强的吸收峰，这是羟基（—OH）的特征峰，说明薯渣中存在着缔合状态的氢键。纤维素、果胶和淀粉的羟基峰出现在3 415 cm-1，果胶/淀粉的羟基峰向3 403 cm-1移动，纤维素/淀粉 的羟基峰向3 407 cm-1移动。羟基峰向低波数移动，说明氢键增强，即果胶、纤维素和淀粉之间存在氢键作用，且果胶和淀粉之间氢键更强[22]。这进一步证实了马铃薯渣中纤维素、果胶组分与淀粉之间存在相互作用，阻碍水与淀粉的接触，抑制了淀粉的糊化以及淀粉酶对淀粉的可及性，从而使得淀粉表现出抵抗酶解的性质。

上述研究结果表明，马铃薯渣中的纤维素和果胶组分对淀粉的酶解具有重要的影响。因此，采用果胶酶和纤维素酶去除马铃薯渣中果胶、纤维素两种组分，解除上述组分对淀粉酶解的阻碍作用，同时也探索提高淀粉酶解效果的有效方法。

2.2.4 酶法预处理对马铃薯渣中淀粉组分酶解效果的影响

表3 果胶、纤维素对淀粉酶解效果的影响Table 3 Influence of pectin and cellulose on enzymatic degradation of starch

由表3可知，采用果胶酶和纤维素酶去除马铃薯渣中果胶和纤维素组分后，α-高温淀粉酶酶解效果明显提高，淀粉组分残存量由原来的20.63%分别降低到5.67%、15.70%和1.28%，即去除果胶、纤维素后淀粉酶解效果显著提高，进一步证明了果胶和纤维素组分是影响淀粉酶解的主要因素，去除果胶和纤维素后能够解除非淀粉组分对淀粉酶解的阻碍。同时，酶法预处理的结果表明，果胶对淀粉酶解的阻碍作用较大，纤维素次之，这可能是果胶作为一种亲水胶体和黄原胶等亲水胶体一样，能够包裹在淀粉颗粒表面，阻碍淀粉的溶出扩散，并且在糊化过程中能够束缚体系中水分子的移动，使参与糊化的水分子减少[13]。果胶亲水胶体的性质使其成为马铃薯渣中淀粉组分难以渗透、糊化不完全的最主要因素，而纤维素对淀粉的包裹缠绕及相互作用力较弱（图5），所以纤维素对淀粉酶解的阻碍作用弱于果胶。

3 结 论

自提马铃薯渣淀粉和普通马铃薯淀粉具有基本一致的结晶形态、糊化特性和酶解效果，其自身不抵抗酶解；马铃薯渣中果胶和纤维素组分与淀粉之间形成氢键，对淀粉具有包裹作用，阻碍了淀粉的渗透溶出、糊化以及和酶的接触，使得马铃薯渣中的淀粉组分表现出了抵抗酶解的性质，且果胶对淀粉酶解的阻碍作用较大，纤维素次之；通过预处理分别去除马铃薯渣中果胶、纤维素以及同时去除这两种组分可使酶法制得的马铃薯渣膳食纤维中淀粉残存量由原来的20.63%分别降低到5.67%、15.70%和1.28%，极大地提高了淀粉的去除效率。

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Mechanism of Potato Pulp Starch Resistance to α-Amylase Degradation

ZHANG Xianmei1, CHENG Li1,2,*, HONG Yan1,2, GU Zhengbiao1,2, LI Zhaofeng1,2
(1. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China; 2. Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition, State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

In order to study the mechanism of potato pulp starch resistant to enzymatic degradation, the nature of starch itself and the impact of other components on enzymatic degradation of starch were investigated. First, potato pulp starch was extracted and its physicochemical properties were examined. The results showed that potato pulp starch itself had no resistance to hydrolysis. Second, the impact of other components on the penetration and gelatinization of starch was studied. As a result, the gelatinization of potato pulp starch was suppressed by other components. Then, the pectin and cellulose were removed by pectinase and cellulose, respectively. These results showed that the starch could be hydrolyzed well after removing pectin and cellulose, and the obstruction by pectin was stronger than by cellulose. The content of residual starch in potato pulp was reduced from the original level of 20.63%to 5.67%, 15.70%and 1.28%after pectin, cellulose and both components were re moved, respectively.

potato pulp; starch; resistance to enzymatic hydrolysis; cellulose; pectin

TS239

A

10.7506/spkx1002-6630-201511011

2014-08-08

广东省专业镇中小微企业服务平台建设专项资金项目（2012B091400030）

张献梅（1988—），女，硕士研究生，研究方向为淀粉科学与工程。E-mail：dearxianmei@163.com

*通信作者：程力（1984—），男，工程师，硕士，研究方向为淀粉深加工。E-mail：chenglichocolate@163.com