A型核纤层蛋白在腰椎退行性疾病中的表达及其意义

欧定强 吴承志 刘钰瑜 戎利民 徐义春 王其友

基础研究论著

A型核纤层蛋白在腰椎退行性疾病中的表达及其意义

欧定强 吴承志 刘钰瑜 戎利民 徐义春 王其友

目的初步探讨A型核纤层蛋白（Lamin A）在腰椎退行性疾病中的表达特点及意义。方法将74例腰椎退行性疾病患者分为腰椎间盘突出组（32例）及腰椎管狭窄组（42例），另设腰椎正常组（12例）作为对照。采用免疫组织化学检查（免疫组化）及蛋白免疫印迹法检测Lamin A 在3组腰椎间盘组织标本中的表达情况。结果免疫组化显示Lamin A在3组的椎间盘细胞中均有表达，腰椎管狭窄组的Lamin A在椎间盘细胞中的表达较腰椎正常组及腰椎间盘突出组明显；蛋白免疫印迹法检测3组椎间盘的纤维环组织均有Lamin A的表达，腰椎管狭窄组Lamin A条带灰度值为3.55 ±0.16，腰椎间盘突出组为1.02±0.13，腰椎正常组为0.78±0.14，3组比较差异有统计学意义（F ＝14.326，P＜0.01），腰椎管狭窄组与腰椎间盘突出组及腰椎正常组比较差异均有统计学意义（P均＜0.001），腰椎间盘突出组与腰椎正常组比较差异尚未有统计学意义（P＝0.134）。结论随着腰椎退行性疾病病程的发展，Lamin A的表达逐渐升高，其可能与腰椎退行性疾病的发生、发展有一定联系。

A型核纤层蛋白；腰椎间盘突出；腰椎管狭窄；表达

腰椎退行性疾病是腰腿痛的重要原因之一。分子机制的调控与腰椎疾病密切相关，有研究显示，A型核纤层蛋白（Lamin A）在细胞的发育过程及细胞应力改变过程中起重要作用，其基因表达的异常及突变是促进退行性疾病发展的因素之一［1-3］。本研究旨在分析该蛋白在腰椎退行性疾病中的表达情况及其意义，为临床提供数据参考。

材料与方法

一、标本采集

选择性获取2014年9月至2015年4月在中山大学附属第三医院行后路腰椎间盘切除术74例患者的腰椎间盘标本。所有患者术前均行常规的腰椎MRI检查，以明确腰椎间盘突出症或腰椎管狭窄症的诊断。74例中腰椎间盘突出32例（腰椎间盘突出组），男17例、女15例，年龄22～46岁，病程6～12个月，其中5例标本用于行免疫组织化学检查（免疫组化），27例标本用于蛋白免疫印迹法检测；腰椎管狭窄42例（腰椎管狭窄组），男24例、女18例，年龄48～68岁，病程6～24个月，7例标本用于行免疫组化，35例标本用于蛋白免疫印迹法检测。腰椎正常组的椎间盘组织来自同期因脊柱骨折损伤在我院就诊而且需行腰椎间盘切除术并椎间融合术的12例患者，其中男7例、女5例，年龄48～68岁，均于脊柱骨折损伤8 h内到我院治疗，其标本均用于行免疫组化。

二、方 法

1.实验试剂及器械

免疫组化：乙二胺四乙酸（EDTA）修复液；5%牛血清白蛋白封闭液；3%的实验用过氧化氢溶液；辣根过氧化物酶（DAB）显色液；苏木素染液；常规的二甲苯、乙醇溶液、磷酸盐缓冲液（PBS）及中性树胶；莱卡病理切片机及倒置显微镜。其所使用抗体与下文的蛋白免疫印迹法检测所用的抗体相同。

蛋白免疫印迹法检测：谷歌生物全蛋白提取试剂盒；凯基生物蛋白浓度测定试剂盒；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺分离胶及5%的浓缩胶；5%脱脂奶粉；目的蛋白一抗抗体（Lamin A）；内参蛋白抗体（组蛋白3）；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜；电化学发光（ECL）液；伯乐电泳及转膜仪；手动曝光板。

2.免疫组化分析Lamin A表达情况

常规在莱卡切片机切取5 μm的椎间盘组织病理切片，于65℃烘箱烘干1.5 h。脱蜡至水后，切片置于EDTA缓冲液中微波修复，加入3%过氧化氢溶液室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶。常规用5%牛血清白蛋白封闭20 min后，于每张切片加入50 μl约1∶200倍稀释的一抗覆盖组织，置于4℃过夜。经PBS清洗后，每张切片加入50～100 μl的二抗，室温孵育2 h。滴加100 μl新鲜配制的DAB，观察到细胞核周出现棕黄色颗粒则为Lamin A阳性表达。用苏木素染液复染切片后，行梯度乙醇（70%～100%，10 min 1个梯度）脱水干燥，经二甲苯透明后行中性树胶封固。通过着色强度判断其表达情况的高低（0～＋4级）［4］。

3.蛋白免疫印迹法检测组织Lamin A的表达

加入体积为纤维环组织体积10倍的裂解液（使用前加入Cooktail蛋白酶抑制剂、苯甲基磺酰氟和磷酸化蛋白酶抑制剂）并使用匀浆器充分碎裂组织，使用凯基生物蛋白浓度测定试剂盒测定所提组织提取液蛋白的浓度。提取液蛋白经过95℃变性后，于10%（或者15%）的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺分离胶及5%的浓缩胶上电泳至蛋白分离。电泳后提取凝胶放置在冰上转至0.45 μm PVDF膜上（250 mA，1 h），常规用5%脱脂奶粉封闭后，加入一抗（1∶1 000）单克隆抗体过夜，于4℃孵育及进行常温下二抗的杂交（组蛋白3作为内参蛋白）。再用ECL液浸润后，放入X光片夹中曝光、定影及进行扫描存档。采用Image J软件分析蛋白质的灰度值。

三、统计学处理

结 果

一、免疫组化结果

免疫组化结果显示Lamin A在椎间盘细胞中均有表达，且主要表达在细胞核的周围。Lamin A在腰椎间盘突出组的表达强度为＋2级（图1B），而在腰椎管狭窄组中的表达较强，为＋4（图1C），在腰椎正常组中的表达强度为＋1（图1A）。

二、蛋白免疫印迹法检测结果

3组椎间盘的纤维环组织均有Lamin A的表达，腰椎管狭窄组Lamin A的表达较腰椎间盘突出组明显（图2）。使用Image J软件分析获取腰椎管狭窄组Lamin A条带灰度值为3.55±0.16，腰椎间盘突出组为1.02±0.13，腰椎正常组为0.78± 0.14，3组比较差异有统计学意义（F＝14.326，P ＜0.01），腰椎管狭窄组与腰椎间盘突出组及腰椎正常组比较差异均有统计学意义（P均＜0.001），腰椎间盘突出组与腰椎正常组比较差异尚未有统计学意义（P＝0.134）。

图1 免疫组化分析Lamin A表达情况

图2 蛋白免疫印迹电泳图

讨 论

腰椎间盘退行性改变是引起腰椎一系列退行性疾病发生的基础，如腰椎管狭窄、腰椎间盘突出、腰椎滑脱及退行性侧弯等，有研究显示其发展与基因的多态性密切相关［5-6］。其中，腰椎间盘突出是腰椎常见疾病之一，其重要的发病机制之一即为椎间盘纤维环受到外界的应力而产生退变及髓核的突出，这表明应力的改变会引起椎间盘纤维环基质的合成与代谢的改变［7］。

Lamin A在细胞生长过程中及应力环境下起重要作用，已有研究表明随着年龄的增长该蛋白在骨骼系统中会不断地减少，而在基因敲除小鼠的研究中也证实了该蛋白表达的减少会引起一系列骨代谢改变［8-11］。因此，探讨Lamin A在腰椎间盘突出症中纤维环组织的表达情况尤为重要，可为椎间盘突出修复提供分子研究的基础。

腰椎间盘突出与腰椎管狭窄有着密切的联系，随着年龄的增长腰椎间盘突出的进展会引起继发性的腰椎管狭窄［12］。在本研究中，腰椎管狭窄组的Lamin A明显高表达，其次为腰椎间盘突出组，腰椎正常组Lamin A表达最低。Lamin A表达的增加使得腰椎组织抗阻及抗压能力下降，加速了纤维环的退变破裂，这种持续性的积累最终使得髓核组织从纤维环处突出引发神经压迫症状。因此，本研究结果提示Lamin A与腰椎间盘疾病的发生、发展有关，我们推测在人的生命进程中，Lamin A可能随着椎间盘压力负荷的增加而增加，从而使疾病进入终末期（腰椎管狭窄组）。

但本研究并未从基因水平上比较腰椎间盘突出、腰椎管狭窄患者及腰椎正常者的Lamin A基因表达的情况，并且未能进行椎间盘髓核细胞的体外实验进一步证实Lamin A在椎间盘退行性疾病中所扮演的角色［13］。有学者利用LaminA／C缺陷的斑马鱼模型证实了胚胎发育过程中LaminA／C缺陷会引发骨骼系统发育的缺陷［14］。另有研究数据也说明了锌基质金属蛋白酶24（Zmpste24）的缺乏会引起LaminA／C基因的缺陷，从而导致干细胞的数量和增殖能力的下降［15］。因此，我们今后需要进行更多的有关Lamin A的基因学研究，以期从基因学方面探讨Lamin A与腰椎间盘退行性疾病发生的关系及相关机制。

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Expression and significance of type A lamin in lumbar spinal degenerative disease

Ou Dingqiang，Wu Chengzhi，Liu Yuyu，Rong Limin，Xu Yichun，Wang Qiyou.Department of Spine Surgery，the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510630，China
Correspondtng author，Wang Qiyou，E-mail：wang＿qiyou＠yeah.net

ObjectiveTo preliminarily explore the expression levels and clinical significance of type A lamin（lamin A）in lumbar spinal degenerative disease.MethodsSeventy four patients diagnosed with lumbar spinal degenerative disease were divided into the lumbar disc herniation（n＝32）and lumbar spinal stenosis groups（n＝42）and healthy subjects were recruited into the control group（n＝12）.The expression of lamin A in the lumbar tissue samples from three groups was assessed by immunohistochemical examination and western blotting.ResultsImmunohistochemical analysis revealed that lamin A was expressed in the intervertebral disk cells from all three groups.The staining of lamin A in the tissue from lumbar spinal stenosis group was stronger than those from the other two groups.Western blot demonstrated that lamin A was expressed in the fibrous ring tissue of intervertebral disk from all three groups.In the lumbar spinal stenosis group，the expression level of lamin A was 3.55±0.16（gray level），1.02±0.13 in the lumbar disc herniation group and 0.78± 0.14 in the control group with statistical significance among three groups（F＝14.326，P＜0.01）.Statistical significance was noted between the lumbar spinal stenosis and lumbar disc herniation group／the control group （both P＜0.001）.There was no statistically significant difference between the lumbar disc herniation and control groups（P＝0.134）.ConclusionsOver the progression of degenerative lumbar spinal disease，the expression level of lamin A is gradually up-regulated，which is probably associated with the incidence and development of degenerative lumbar spinal disease.

Type A lamin；Lumbar disc herniation；Lumbar spinal stenosis；Expression

2015-06-07）

（本文编辑：洪悦民）

10.3969／j.issn.0253-9802.2015.11.003

广东省科技计划项目（2012B040304006）；2012年广东省大学生创新创业训练计划项目（1057112012）

510630广州，中山大学附属第三医院脊柱外科（欧定强，吴承志，戎利民，徐义春，王其友）；524000湛江，广东医学院药理教研室（刘钰瑜）

，王其友，E-mail：wang＿qiyou＠yeah.net

并列第一作者，吴承志