实验性脑震荡大鼠脑皮质肿瘤坏死因子－α的表达

严琦敏，张排旗，赵 波，张新宇，付学锋(解放军第医院普通外科，西安 70054;第四军医大学唐都医院消化内科;兰州军区兰州总医院神经内科;共同第作者;通讯作者，E-mail:lkyyfxf@6．com)

颅脑损伤发病率的急剧上升已成为发展中国家医学关注重点。WHO分析认为，作为神经外科常见急重症的创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)在不久将可能位居全球疾病第3位，而交通事故则是最主要的致病原因［1-3］。TBI的轻型损伤是脑震荡(cerebral concussion)，其发生率很高且机制不明［2-4］。TBI患者继发性脑损伤所致的病理生理改变决定疾病的转归和预后，与继发性脑损伤相关的因素有钙超载、炎症反应、缺血缺氧、兴奋性氨基酸和某些自由基等［1］。

在哺乳动物大脑的免疫反应和炎症活动中，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)发挥着重要作用，它作为脑内重要的细胞因子，也是机体炎症或组织损伤的介质。TNF-α在激活神经胶质细胞和促进胶质细胞增生，以及组织的瘢痕形成等炎症发生发展中发挥重要作用［1，4］。我们通过实验方法，在建立大鼠单纯性脑震荡(pure cerebral concussion，PCC)模型后应用免疫组织化学方法检测损伤后不同时间点TNF-α在大脑前额叶皮质、颞叶皮质和梨状皮质的表达变化，从而探讨TNF-α与脑损伤病理生理变化的关系。

1 材料与方法

1．1 主要试剂与仪器

过氧化物酶阻断剂和非免疫羊血清为北京中衫金桥公司厂品;多克隆兔抗TNF-α抗体为上海桥星贸易有限公司提供;辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG为北京康为世纪生物科技有限公司提供;图文分析系统Image-Pro Plus6．0软件为美国 Media Cybernetics公司提供;光学显微镜用Olympus BX51TPHD-J11型(日本)。

1．2 建立大鼠单纯性脑震荡(PCC)模型

健康雄性SD大鼠42只，体重(280．4±12．2)g(第四军医大学实验动物中心)，实验前适应性喂养2周。大鼠随机分为正常对照组6只，损伤组36只。参照文献［5，6］方法建立损伤组大鼠模型，于大鼠额顶部用“金属单摆闭合脑损伤打击装置”进行钝性一次性打击，然后用类回归方程分析脑震荡昏迷和恢复过程相关指标和时间参数变化，将大鼠随机分为1，12，24，48，72 h 和7 d 共6 个损伤组，每组6只。

1．3 标本采集与组织切片

用10%水合氯醛钠(2．5 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定于冰袋上降低氧耗，然后用含多聚甲醛(4%)的磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7．2-7．4)腹腔灌注，取出脑组织再以含多聚甲醛(4%)的PBS固定液在4℃恒温条件下固定48 h，将标本进行石蜡包埋，冠状断面进行连续切片(片厚为10-15 μm)，用于免疫组织化学。

1．4 免疫组织化学(SP法)检测TNF-α

将脑组织石蜡切片脱蜡至水、抗原热修复和PBS漂洗，加入内源性过氧化物酶阻断剂(1∶150)室温孵育10 min，PBS漂洗。滴加非免疫羊血清室温封闭10 min。去除血清后直接滴加一抗为多克隆兔抗 TNF-α(1∶100)，4 ℃孵育24 h。室温下 PBS 漂洗，滴加生物素标记的山羊抗兔IgG(1∶50)，室温孵育15 min。辣根酶标记链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液(1∶150)在室温下孵育15 min，再以0．1%PBS triton 缓冲液(pH=7．4)漂洗，用 DAB 显色3-10 min终止反应。空白对照用 PBS(0．01 mol/L)替代一抗，操作步骤同上。

1．5 图像采集分析

根据选定的部位(图1)进行图像采集。选取大鼠脑组织的前额叶皮质(PC)的一区(PC1)和二区(PC2)、颞叶皮质区(TC)和梨状皮质区(Pir)进行检测。图文分析系统用Image-Pro Plus 6．0软件，以TNF-α阳性棕色反应细胞作为分析区(area of interest，AOI)进行光密度值(optical density，OD)测定，每个部位连续选取5个高倍显微镜视野(×400)测出阳性反应物，最后计算出平均光密度值(AOD)，同时对同一时间点大鼠脑组织阳性细胞进行计数。

图1 大鼠脑分区示意图Figure 1 Brain areas diagram of rat

1．6 统计学分析

TNF-α阳性细胞AOD值和阳性细胞计数通过图像确定，数据用±s表示。单因素方差分析(One-Way，ANOVA)用 SPSS 13．0 统计软件，P ＜0．05即认为差异有统计学意义。

2 结果

在PC1、PC2、TC和Pir 4个脑分区 TNF-α阳性表达和TNF-α阳性细胞变化基本相似，未见明显差异，故用PC1和TC进行结果分析。

PCC大鼠脑组织细胞中TNF-α强弱和阳性细胞多少与着色相关，表达明显染色越深，阳性细胞轮廓就越清晰可见，典型TNF-α阳性细胞轮廓清晰，细胞质呈棕褐色，细胞核不着色。PCC大鼠PC1(图2A-G)和TC(图2H-N)两个脑区各时间点免疫组化染色表明，正常对照组 PC1(图2A)和TC(图2H)脑区有少量散在的TNF-α表达较弱的阳性细胞且轮廓不清晰。PCC大鼠PC1(图2B-E)和TC(图2I-L)脑区TNF-α阳性细胞染色和阳性细胞数均依时间延长(1，12，24，48 h)染色逐渐变深至棕褐色且细胞数量增多，72 h(图2F，M)达到高峰，7 d(图2G，N)阳性细胞染色减弱且数量减少，但仍未达到正常对照水平。与正常对照组比较，PCC大鼠不同时间点细胞 TNF-α表达(DOI)和阳性细胞数均有显著差异(P ＜0．05，见图3)。

图2 PCC大鼠不同时间点PC1和TC区免疫组化染色TNF-α阳性细胞数Figure 2 The positive cells of TNF-α immunoreactivity expression in the cortex of PCC rats

图3 PCC大鼠不同时间点PC1和TC区TNF-α阳性表达和阳性细胞数Figure 3 The immunoreactivity expression and number of TNF-α positive cell at different time points in PC1 and TC of the rats after PCC

3 讨论

本实验研究表明，TNF-α阳性表达和TNF-α阳性细胞变化在 PC1、PC2、TC和Pir脑分区基本相似，正常对照组大鼠前额叶皮质(PC)、颞叶皮质(TC)和梨状皮质(Pir)脑区均可见少量散在的TNF-α弱阳性的表达。PCC大鼠TNF-α免疫阳性表达随着造模时间推移逐渐增强，同时阳性细胞染色后轮廓变为清晰，且阳性细胞的计数变化相同。72 h的PCC大鼠，TNF-α阳性表达和TNF-α阳性细胞数均达到峰值，并于7 d呈现下降趋势，但仍未达到正常对照水平。我们研究提示，实验性大鼠PCC损伤大脑PC区和TC区TNF-α表达出现明显改变，表明TNF-α可能参与PCC所致伤损后的病理生理变化过程。

研究表明，脑震荡早期缺血缺氧损伤的病理过程中有多种炎症因子参与，包括TNF-α、白细胞介素和神经肽类等，而TNF-α含量变化与脑血流变化呈正相关［10-13］，TNF-α的表达水平可以间接表明脑组织损伤的程度［14-16］。监测脑震荡患者血清中TNF-α水平的变化可作为治疗效果评定和预后分析的依据之一［17-19］。用自由落体撞击装置复制脑震荡大鼠模型，通过免疫组织化学等方法研究认为，TNF-α表达阳性主要见于大脑皮质和海马区的神经细胞胞质内，伤后即可出现表达并缓慢增强，数日内达到高峰，大多数于 1周出现下降，2周基本恢复正常［4-6］。本研究结果与既往报道相类似［17-19］，细胞中TNF-α表达和阳性细胞于3 d达高峰，7 d接近正常水平。多数研究表明［20-24］，大脑缺血缺氧性损伤后TNF-α均可呈现表达上调的反应，通过测定可以间接证实TNF-α参与了脑损伤发生早期病理过程的炎症反应。研究脑损伤过程中TNF-α在表达时间上的报道有一定的差异，这种现象可能与研究的对象、动物模型构建和研究所采用的方法等因素相关［12-15］。TNF-α介导脑损伤炎症反应的机制比较复杂，目前研究认为，其机制可能与下列因素有关:①外力因素致使大脑微循环功能障碍，出现血管通透性增高和血-脑屏障被破坏，形成脑水肿或脑水肿加重，TNF-α与脑损伤后病理改变互为因果［6］。②活化炎症反应细胞，对血管内皮细胞表达的相关黏附分子-1(ICAM-1)、白介素(IL)发挥激活作用，同时加强白细胞与内皮细胞间黏附促使炎细胞向外浸润血管［20-22］。③影响星形胶质细胞对神经生长因子的表达，促进脑胶质细胞增生和修复［1，22］。④具有抗炎和促炎双向作用。外伤性脑血管功能紊乱或脑水肿时表现为抑制免疫反应，当病变恢复时则具有促进炎症消退作用，这一过程可能通过脑损伤时细胞间信号转导级联反应来实现［20］。TNF-α作为炎性介质所发挥的功能效应受其浓度、作用时间和所针对受体，以及作用的时机等因素的影响［4，11-13］。

脑震荡(cerebral concussion)是暂时性的中枢神经系统功能障碍，大多数是轻度暴力作用于头部致使短暂性意识丧失和近事忘却，属于一过性神经功能改变而无器质性损害［1，22］。已有研究发现，受暴力直接作用部位的神经元线粒体可出现肿胀和神经轴突损伤，特别是反复或持久的脑震荡患者，脑组织的轴突变性明显，并伴代谢紊乱，这或许是引起后遗症的重要因素［23-25］。在脑损伤中，PCC属于最轻型，特别是作为联合皮质重要部分的前额叶皮质受力后，大多数患者在学习、注意力和判断力等方面都可能出现障碍［23-26］，因为受伤部位是学习记忆功能的关键部位［17］。研究认为，大鼠海马、颞叶皮质和梨状皮质是空间学习和记忆中枢，而梨状皮质还与嗅觉和情绪等功能有关［22］。本实验发现，PCC致伤后PC、TC和Pir脑区均有TNF-α表达增强的改变，已有研究证实这可能影响大鼠的学习和记忆等功能［1，24-26］。PCC 后 TNF-α 表达水平与大脑损伤程度和中枢神经系统的认知障碍密切相关，对大脑损伤患者检测TNF-α表达水平是反应损害严重程度的一个侧面［27-29］。

由于认知功能障碍与TNF-α之间存在一定的相关性，因此，本实验从PCC模型大鼠的PC、TC和Pir脑区测定神经元TNF-α表达和阳性细胞数量角度进行分析，从而证实PCC与学习记忆存在一定的相关性［28-30］。我们推断，颅脑损伤导致的 TNF-α上调对组织细胞损伤可能有明显促进作用，临床上通过人为方法抑制TNF-α表达可能有助于延缓或减轻损伤后的病理生理反应。进一步研究TNF-α在脑损伤病理过程中作用机制并找出抑制策略，这对减轻患者脑损伤后遗症有一定指导作用［31］。

［1］ 江基尧．现代颅脑损伤学［M］．3版．上海:第二军医大学出版社，2010:625-726，810-819．

［2］Krishnadas R，Nicol A，Sassarini J，et al．Circulating tumour necrosis factor is highly correlated with brainstem serotonin transporter availability in humans［J］．Brain Behav Immun，2015，pii(15):429-438．

［3］Becker D，Deller T，Vlachos A．Tumor necrosis factor(TNF)-receptor 1 and 2 mediate homeostatic synaptic plasticity of denervated mouse dentate granule cells［J］．Sci Rep，2015，5:12726．

［4］Miyatake S，Nonoguchi N，Furuse M，et al．Pathophysiology，diagnosis，and treatment of radiation necrosis in the brain［J］．Neurol Med Chir(Tokyo)，2015，55(1):50-59．

［5］Opp MR，George A，Ringgold KM，et al．Sleep fragmentation and sepsis differentially impact blood-brain barrier integrity and transport of tumor necrosis factor-α in aging［J］．Brain Behav Immun，2015，pii(15):418-423．

［6］于建云，李俊祥，郭泽云，等．实验大鼠轻中型闭合性脑损伤分级的昏迷指数与量化标准研究［J］．法医学杂志，2008，24(1):8-11．

［7］于建云，李俊祥，李娟娟，等．三重脑震荡鼠模型建立及组织病理学动态改变观察［J］．中华神经外科疾病研究杂志，2010，9(3):337-340．

［8］De Nuccio C，Bernardo A，Cruciani C，et al．Peroxisome proliferator activated receptor-γ agonists protect oligodendrocyte progenitors against tumor necrosis factor-alpha-induced damage:Effects on mitochondrial functions and differentiation［J］．Exp Neurol，2015，271(2):506-514．

［9］彭瑞云，高亚兵，肖兴义，等．肿瘤坏死因子-α和细胞间黏附分子-1在大鼠实验性脑震荡脑组织中的表达研究［J］．中国危重病急救医学，2002，14(6):662-664．

［10］郭莲怡，金旭鹏，王桂君，等．肿瘤坏死因子-α对大鼠离体灌注肾血管收缩的影响［J］．中国老年学杂志，2015，35(13):3510-3512．

［11］陈新云．炎症因子在大鼠脑缺血后MMP和TIMP-1致脑损伤中的作用［J］．中山大学学报(医学科学版)，2013，34(3):230-234．

［12］Raivich G，Banati R．Brain microglia and blood-derived macrophages:molecular profiles and functional roles in multiple sclerosis and animal models of autoimmune demyelinating disease［J］．Brain Res Brain Res Rev，2004，46(3):261-281．

［13］牛廷献，史智勇，罗建军．缺血缺氧脑损伤大鼠IL-6和TNF9的变化及其临床意义［J］．放射免疫学杂志，2009，22(4):559-562．

［14］Thanasupawat T，Glogowska A，Burg M，et al．RXFP1 is targeted by complement C1q tumor necrosis factor-related factor 8 in brain cancer［J］．Front Endocrinol(Lausanne)，2015，6(1):127-132．

［15］Biesmans S，Bouwknecht JA，Ver Donck L，et al．Peripheral administration of tumor necrosis factor-alpha induces neuroinflammation and sickness but not depressive-jike behavior in mice［J］．Biomed Res Int，2015，2015:716920．

［16］Sonar S，Lal G．Role of tumor necrosis factor superfamily in neuroinflammation and autoimmunity［J］．Front Immunol，2015，6(2):364-639．

［17］Mishra P，Prasad KN，Singh K，et al．Tumor necrosis factor-α and interleukin-1β gene polymorphisms and risk of brain abscess in North Indian population［J］．Cytokine，2015，75(1):159-164．

［18］Zhang W，Li B，Guo Y，et al．Rhamnetin attenuates cognitive deficit and inhibits hippocampal inflammatory response and oxidative stress in rats with traumatic brain injury［J］．Cent Eur J Immunol，2015，40(1):35-41．

［19］Morioka N，Zhang FF，Nakamura Y，et al．Tumor necrosis factormediated downregulation of spinal astrocytic connexin43 leads to increased glutamatergic neurotransmission and neuropathic pain in mice［J］．Brain Behav Immun，2015，49:293-310．

［20］Nigim F，Cavanaugh J，Patel AP，et al．Targeting hypoxia-inducible factor 1α in a new urthotopic model of glioblastoma recapitulating the hypoxic tumor microenvironment［J］．J Neuropathol Exp Neurol，2015，74(7):710-722．

［21］Ding Z，Liu Y，Yao L，et al．Spy1 induces de-ubiquitinating of RIP1 arrest and confers glioblastoma’s resistance to tumor necrosis factor(TNF-α)-induced apoptosis through suppressing the association of CLIPR-59 and CYLD［J］．Cell Cycle，2015，14(13):2149-2159．

［22］Meroni PL，Valentini G，Ayala F，et al．New strategies to address the pharmacodynamics and pharmacokinetics of tumor necrosis factor(TNF)inhibitors:A systematic analysis［J］．Autoimmun Rev，2015，14(9):812-829．

［23］黄伯儒，赵海平，胡文秀．髓鞘碱性蛋白、TNF-α和IL-6在实验性大鼠胰性脑病中的水平变化及相关性研究［J］．中国普外基础与临床杂志，2015，22(7):816-821．

［24］张中菊，刘晓丽，易桂标，等．正清风痛宁对偏头痛大鼠脑干IL-1β、TNF-α表达的影响［J］．中国神经免疫学和神经病学杂志，2015，22(2):96-100．

［25］Chi L，Na MH，Jung HK，et al．Enhanced delivery of liposomes to lung tumor through targeting interleukin-4 receptor on both tumor cells and tumor endothelial cells［J］．J Control Release，2015，209(1):327-36．

［26］李报，黄大可，桂丽，等．载脂蛋白E基因敲除小鼠脑部TNF-α和IL-1β及IL-8的水平升高［J］．细胞与分子免疫学杂志，2015，31(5):581-584．

［27］Camara ML，Corrigan F，Jaehne EJ，et al．Tumor necrosis factor alpha and its receptors in behaviour and neurobiology of adult mice，in the absence of an immune challenge［J］．Behav Brain Res，2015，290(1):51-60．

［28］Bimpis A，Papalois A，Voumvourakis K，et al．Neuronal tumour necrosis factor-α and interleukin-1β expression in a porcine model of intracerebral haemorrhage:Modulation by U-74389G［J］．Brain Res，2015，1615(1):98-105．

［29］Baratz R，Tweedie D，Wang JY，et al．Transiently lowering tumor necrosis factor-α synthesis ameliorates neuronal cell loss and cognitive impairments induced by minimal traumatic brain injury in mice［J］．J Neuroinflammation，2015，12(1):45-49．

［30］Gerard E，Spengler RN，Bonoiu AC，et al．Chronic constriction injury-induced nociception is relieved by nanomedicine-mediated decrease of rat hippocampal tumor necrosis factor［J］．Pain，2015，156(7):1320-1333．

［31］Weinberger JF，Raison CL，Rye DB，et al．Inhibition of tumor necrosis factor improves sleep continuity in patients with treatment resistant depression and high inflammation［J］．Brain Behav Immun，2015，47(2):193-200．