二花脸猪产仔数性状的分子标记及其效应分析

徐小波， 冯 宇， 陆志强， 胡东卫， 陈 哲

(1.江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏 南京 210014;2.江苏省常熟市畜牧兽医站，江苏 常熟 215500)

控制猪产仔数的基因或标记已报道的有雌激素受体基因(ESR)［1］、促卵泡素 β 亚基基因(FSHβ)［2］、催乳素受体基因(PRLP)［3］和表皮生长因子基因(EGF)［4］等。它们是母猪生殖调节的关键基因，是生殖激素的受体基因，参与调节猪生殖道、卵巢及泌乳等的生长发育等。二花脸猪是江苏省最优秀猪种之一，以繁殖力高、肉质优良而著称于世。本试验选择FSHβ、ESR和PRLP 3个功能基因作为候选基因，采用PCR-RFLP进行多态性检测，同时对3个候选基因对二花脸猪的产仔与哺育性状进行相关性分析，以揭示二花脸猪高繁殖力的分子遗传机理，为二花脸猪的种质资源保护及开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验猪群

试验猪群为常熟市牧工商总公司二花脸保种猪场的育种核心群108头母猪。母猪繁殖成绩统计范围为所有核心群母猪初产和经产的纯种繁殖产仔哺育记录。母猪群系谱资料完整，各胎配种与繁殖记录齐全，仔猪哺乳期为35 d。

1.2 试验方法

1.2.1 采样与DNA提取 用猪用耳缺钳夹取一小块耳缘组织(约0.10～0.15 g)，浸于EP管内70%乙醇中，-20℃冷冻保存。采用苯酚法提取DNA。

1.2.2 引物设计 分别参照赵要风等［2］、Short等［5］和 Drogemuller 等［6］的文献设计 FSHβ、ESR、PRLR基因多态位点引物。FSHβ-F:5'-CCTTTAAGACAGTCAATGGC-3';FSHβ-R:5'-ACTGGTCTATTCATCCTCTC-3'。ESR-F:5'-CCTGTTTTTACAGTGACTTTTACAGAG-3';ESR-R:5'-CACTTCGAGGGTCAGTCCAATTAG-3'。PRLR-F:5'-CGTGGCTCCGTTTGAAGAACC-3';PRLR-R:5'-CTGAAAGGAGTGCATAAAGCC-3'。引物用去离子水溶解，-20℃保存。

1.2.3 PCR反应 反应总体积为25.0 μl，Premix Ex Taq 12.5 μl，两端引物(100 μmol/L)各 0.5 μl，模板 DNA 1.0 μl，加纯水至 25.0 μl。PCR 反应条件为:95℃预变性5 min;94℃变性30 s、55℃退火45 s、72℃延伸45 s，32个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物经电泳检测后置于4℃保存。

1.2.4 酶切与电泳 ESR和PRLR基因扩增产物分别用PvuⅡ和AluⅠ限制性内切酶进行酶切。酶切反应体系为:2.0 μl 10× NEB 缓冲液，0.2 μl 100 × BSA，0.5 μl内切酶，PCR 产物 5.0 μl，加纯水至20.0 μl。酶切反应条件:37℃，反应时间 4～6 h。ESR和PRLR基因经酶切后进行2%琼脂糖凝胶电泳分析，FSHβ基因扩增产物直接进行电泳分析。

1.3 统计分析

分别统计初产和经产的总产仔数(TNB)、产活仔数(NBA)、初生质量(BW)和断奶质量(WW)。采用SPSS统计软件包进行统计分析。

2 结果

2.1 FSHβ、ESR和PRLR基因在二花猪中的基因频率

二花脸猪FSHβ、ESR和PRLR基因的基因型和基因频率分布见表1。经卡方适合性检验，二花脸猪群体内FSHβ基因只发现2种基因型，AA型和AB型，ESR和PRLR基因有AA型、AB型和BB型3种基因型，基因型分布均符合哈迪-温伯格平衡(P ＞0.05)。

表1 FSHβ、ESR和PRLR基因在二花脸猪群中的基因型频率和基因频率Table 1 Gene and genotype frequencies of ESR，PRLR and FSHβ genes in Erhualian sows

2.2 FSHβ、ESR和PRLR基因多态性与二花脸猪产仔性能的关联性

FSHβ、ESR和PRLR各基因型初产和经产的总产仔数(TNB)和产活仔数(NBA)列于表2。FSHβ基因在二花脸猪群体中只检测到AA型和AB型，AA型无论初产和经产TNB和NBA均显著或极显著高于AB型;ESR基因BB型个体的初产及经产的TNB和NBA均显著或极显著高于AB型和AA型，AB型的初产NBA、经产TNB和NBA均显著或极显著高于AA型;PRLR基因的AA型为有利基因型，AA型和AB型初产和经产TNB和NBA均极显著高于BB型，AA型和AB型之间差异不显著。

表2 不同基因型二花脸猪的总产仔数与产活仔数Table 2 Total number of born and number of born alive of different genotypes of Erhualian sows

2.3 FSHβ、ESR和PRLR基因多态性与二花脸仔猪初生质量、断奶质量的关联性

FSHβ、ESR和PRLR各基因型初产和经产的初生质量(BW)和断奶质量(WW)列于表3。FSHβ基因的AB型初产和经产BW和WW均显著高于AA型。ESR基因的AA型初产和经产BW显著高于AB和BB型，AA型的初产和经产WW显著高于BB型，AA型是仔猪体质量优势基因。PRLR基因的BB型初产和经产仔猪的WW均显著高于AA型，其余差异不显著，BB型为仔猪体质量优势基因。

表3 不同基因型二花脸猪所产仔猪的初生质量和断奶质量Table 3 Birth weight and weaning weight for different genotypes of Erhualian sows

3 讨论

3.1 基因多态性分析

赵要风等［2］在二花脸猪和香猪内只发现了FSHβ基因的A等位基因，本研究中未发现FSHβ基因的BB基因型，B等位基因频率为0.22。陈克飞等［7］报道ESR基因的B等位基因在国内猪种中占优势(0.73)，在二花脸猪群体中也表现为B基因频率较高。本研究PRLR基因多态性表现与李婧等［8］的检测结果一致。群体的遗传平衡检测结果表明，二花脸猪尚处于稳定遗传平衡状态。

3.2 基因多态性与产仔数的关联性

赵要风等［2］认为 FSHβ是猪产仔性状主效基因，AA基因型的产仔数明显提高［8-9］。本研究的二花脸猪群体内，B基因的频率很低，与其他地方猪种的基因频率类似［9-11］，本研究结果表明AA型的初产和经产总产仔数(TNB)和产活仔数(NBA)均较AB型略高，A基因为优势基因。

有研究者认为ESR基因的每个B基因能提高产仔数 0.3 ～1.5 头［1，10］。丁家桐等研究发现，ESR基因对TNB和NBA的效应在3个地方猪种中效应极显著，每个B基因对TNB和NBA的加性效应分别为1.52头和1.50头［12］。本研究结果也表明，二花脸猪ESR基因BB型为优势基因型，B基因频率达到0.817，且ESR基因的BB基因型个体初产和经产的TNB和NBA显著高于AA型个体(P＜0.01)，与国内其他猪种相似［7］，说明ESR基因也是控制猪产仔数性状的主效基因，而且二花脸猪有较高的繁殖性能的潜力。

关于PRLR基因与产仔数的关联性研究结果存在一定分歧，部分研究者认为A等位基因能显著提高产仔数［13-14］，但另一部分研究者则认为B基因对猪产仔数更有利［6，15］。PRLR基因在不同猪种中的多态性及其与繁殖性状的关系尚无定论。本研究与李婧等［10］的研究结果一致，PRLR基因的A等位基因为优势基因，AA基因型TNB和NBA均显著高于BB基因型。

3.3 基因多态性与初生质量、断奶质量的相关性

部分研究者认为FSHβ、ESR和PRLR基因对仔猪初生质量(BW)和断奶质量(WW)没有显著影响［16-17］，但也有研究者认为，PRLR基因对初生窝质量有作用，且在国内外猪种中的表现显著不同［18］。本研究中，PRLR基因对初产和经产仔猪的WW效应显著，ESR基因对初产、经产的BW和WW均有显著影响。本研究中二花脸猪的TNB和NBA与BW之间存在显著的负相关，这与在金华猪上的研究结果［19］一致。这为二花脸猪的分子标记辅助选择提供了新的依据和参考。

繁殖性状遗传率很低，受微效多基因调控，同时也受到品种、胎次、营养及环境等多方面的影响。通过对产仔数的表型选择提高种群的产仔数收效甚微，但是通过对诸多与产仔数相关的候选基因的研究，将一些主效基因作为分子标记进行合并选择，对提高种群产仔数将是一个有效的方法。

［1］ ROTHSCHILD M，JACOBSON C，VASKE D，et al.The estrogen receptor locus is associated with a major gene influencing litter size in pigs［J］.Pnas USA，1996，93(1):201-205.

［2］ 赵要风，李 宁，肖 璐，等.猪FSHβ亚基基因结构区逆转座子插入突变及其与猪产仔数关系的研究［J］.中国科学(C辑)，1999，29(1):81-86.

［3］ VAN RENS B T，EVANS G J，VAN DER LENDE T.Components of litter size in gilts with different prolactin receptor genotypes［J］.Theriogenology，2003，59(3-4):915-926.

［4］ 周利华，肖石军，杨广成，等.猪表皮生长因子基因的遗传变异及其与产仔性状的相关性分析［J］.中国畜牧兽医，2010，37(5):147-150.

［5］ SHORT T H，ROTHSCHILD M F，SOUTHWOOD O I，et al.Effect of the estrogen receptor locus on reproduction and production traits in four commercial lines［J］.J Anim Sci，1997，75(12):3138-3142.

［6］ DROGEMULLER C，HAMANN H，DISTL O.Candidate gene markers for litter size in different German pig lines［J］.J Anim Sci，2001，79(10):2565-2570.

［7］ 陈克飞，黄路生，李 宁，等.猪雌激素受体(ESR)基因对产仔数性状的影响［J］.遗传学报，2000，27(10):853-857.

［8］ 李 婧，孟 和，李长龙，等.ESR和PRLR基因对民猪产仔数的影响［J］.黑龙江畜牧兽医，2003(4):11-12.

［9］ 柳淑芳，杜立新，闫艳春.莱芜黑猪 FSHβ亚基基因的多态性分析［J］.山东农业大学学报，2002，33(4):403-408.

［10］李 婧，杨润清，孟 和，等.民猪产仔数性状四个候选基因效应分析［J］.上海交通大学学报:农业科学版，2004，22(1):74-77.

［11］李国治，连林生，鲁绍雄，等.撒坝猪促卵泡素β亚基基因多态性及其与初产产仔性能相关性研究［J］.养猪，2005(2):22-23.

［12］丁家桐，葛红山，姜勋平，等.猪雌激素受体基因与产仔数和乳头数的关系［J］.南京农业大学学报，2002，25(2):79-81.

［13］ VINCENT A I，TUGGLE C K，ROTHSCHILD M F，et al.The prolactin receptor gene is associated with increased litter size in pig［R］.Armidale:Proceedings of the 6th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production，1998.

［14］ VAN RENS B T，VAN DER L T.Litter size and piglet traits of gilts with different prolactin receptor genotypes［J］.Theriogenology，2002，57(2):883-893.

［15］孙延晓，曾勇庆，陈其美，等.八个猪种 PRLR和 RBP4基因PCR-RFLP检测及群体遗传特性研究［J］.山东农业大学学报:自然科学版，2008，39(4):544-548.

［16］孙菊英，吕钢进，王友杉，等.嵊县花猪PRLR基因多态性与繁殖性状的相关分析［J］.浙江畜牧兽医，2010(3):1-3.

［17］李千军，王立刚，穆淑琴，等.ESR、FSHβ及OPN基因多态性与母猪繁殖性状的关联分析［J］.中国畜牧兽医，2010，37(10):139-143.

［18］胡雪松，王希彪.民猪、长白猪及其杂种母猪催乳素受体(PRLR)基因的NaeⅠ多态性与繁殖性状的相关分析［J］.畜牧兽医学报，2006，37(11):1135-1140.

［19］谢保胜.应用约束性最大似然法(REML)估计金华猪繁殖性状和生长性状的遗传参数［D］.杭州，浙江大学，2002.