木瓜提取液对大鼠骨组织中ColⅠ和Cath L表达的影响

李旭斌，陈秀峰，王桂敏，艾 浩

（1辽宁医学院 研究生院，辽宁 锦州 121001；2航天中心医院 普外科，北京 100049；3辽宁医学院 第一附属医院，辽宁 锦州 121001）

木瓜属蔷薇科木瓜属落叶灌木植物，其用途广泛，可食用、药用.现代研究发现木瓜有杀虫抗炎、抗结核、通乳抗癌、解痉止痛、促进损伤肝细胞修复、抑制肾移植后的抗血管内皮细胞及T、B淋巴细胞抗体、降低血糖、促进新陈代谢、美容抗衰老、抗骨质疏松等多种作用.骨质疏松症（Osteoporosis，OP）是一种以骨量降低和骨组织微结构破坏为特征，进而骨骼脆性增加，容易发生骨折的系统性疾病［1］.随着世界人口老龄化的加快，OP在全世界发病率逐年上升，绝经后妇女发病率更高，其特征是骨量减少，骨组织的显微结构改变，骨折的危险性增大.临床治疗药物主要包括:激素调节药物（雌激素等）、促进骨形成药物（甲状旁腺激素）、促进骨矿化药物（维生素D、钙剂）等.这些药物对治疗OP有效，但伴随有严重副作用，如激素长期治疗出现的血凝状态、高血压、水肿［2］、子宫内膜癌、乳腺癌等［3］.本文通过建立去势后大鼠骨质疏松模型，观察木瓜提取液对去卵巢大鼠破骨细胞组织蛋白酶L（Cath L）表达以及成骨细胞Ⅰ型胶原（ColⅠ）代谢的影响，为临床治疗绝经后骨质疏松寻求理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

木瓜由辽宁医学院附属第一医院中药局提供，PINP、ICTP检测试剂盒均购自美国sigma公司，ColⅠ、Cath L试剂购于上海康洪生物科技有限公司，10%水合氯醛溶液、4%多聚甲醛溶液购自辽宁医学院科学实验中心，尼尔雌醇购自北京益民药业（批号0904100）.3个月龄雌性SD大鼠，体质量200～220g，由辽宁医学院科学实验中心提供（动物合格证号:LJ08023）.

1.2 药物制作

将木瓜50g用15倍量的水浸泡30min后，沸水煎煮20min，药液放入浓缩缸内浓缩.木瓜低剂量组按人与大鼠体表面积1∶0.0179比例换算大鼠每天用药量，相当于15.2g/kg含生药量；木瓜高剂量组含生药量是低剂量组的4倍，相当于60.8g/kg的含生药量.以上药物给药容积为1.79mL，灌胃，每日一次.雌激素组给予1.5mg/kg的尼尔雌醇，用生理盐水稀释成等体积混悬液.

1.3 动物分组及模型制做

将50只健康成年SD大鼠，按完全随机数字法分为5组，每组10只:假手术组、模型组、雌激素组、木瓜低剂量组、木瓜高剂量组.将各组大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3mL/100g体重），以俯卧姿势固定在手术架上，在季肋、腋中线和脊柱外侧入路暴露双侧卵巢，除假手术组仅暴露外，其余各组均切除双侧卵巢.术后肌注青霉素1万u/只，连用3 d.术后第2天开始行阴道细胞涂片检查，每天一次，连续5d，如果阴道上皮角化细胞无周期性变化，证明卵巢去除成功.

1.4 给药方式

按大鼠体重计算每日用药量；假手术组和模型组每日给予1.79mL等量生理盐水；雌激素组灌胃尼尔雌醇1.5mg/kg，1次/3d，其余2d灌胃等量生理盐水；木瓜低剂量组每日灌胃1.79mL木瓜提取液（含3.04g生药），木瓜高剂量组每日灌胃1.79mL木瓜提取液（含9.12g生药），每天一次，连续12周.

1.5 标本检测及方法

1.5.1 骨形态学指标的测定 右侧股骨用4%多聚甲醛溶液固定24h后用10%EDTA脱钙，常规石蜡包埋，取股骨髁部相同部位制成5μm厚的组织切片，HE染色，光镜下行病理形态检查.

1.5.2 骨生化指标的测定 PINP和ICTP均用试剂盒采用酶联免疫吸附法测定.

1.5.3 分子生物学指标的测定 Cath L和ColⅠ蛋白采用SABC免疫组织化学染色法测定.

1.5.4 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行分析处理，数据用（＋s）表示.多组间比较用单因素方差分析，P＜0.05差别有统计学意义.

2 结果

2.1 对大鼠PINP，ICTP表达的影响

由表1可见，与模型组比较:木瓜高剂量组和雌激素组血清PINP含量显著升高（P＜0.05）；木瓜高剂量组和雌激素组血清ICTP含量显著下降（P＜0.05）；木瓜高剂量组与雌激素组比较没有显著差异（P＞0.05）.而木瓜低剂量组与模型组比较显著下降（P＜0.05）.

表1 各组大鼠PINP，ICTP表达（x±s，n＝10）Tab.1 PINP and ICTP expression in the difference groups（x±s，n＝8）

2.2 木瓜对ColⅠ蛋白表达的影响

由表2可见，ColⅠ蛋白主要在成骨细胞胞浆及细胞间质表达，染色为棕黄色或深棕黄色纤维状或颗粒状提示阳性.在骨细胞胞浆中亦有少量表达.光镜下观察各组照片可以发现，木瓜高剂量组、木瓜低剂量组、雌激素组和假手术组蛋白阳性.与假手术组相比，模型组大鼠皮质骨及骨小梁中染色较浅.与模型组比较，木瓜高剂量组、木瓜低剂量组、雌激素组的灰度增加.

2.3 木瓜对Cath L蛋白表达的影响

由表2可见，Cath L蛋白主要在骨小梁周围的破骨细胞胞浆中表达，阳性染色为棕黄色，成骨细胞周围亦可见到少量阳性颗粒.光镜下观察各组照片可见，于假手术组比较，模型组Cath L蛋白的表达明显增多，木瓜组和雌激素组显著减少.

表2 各组免疫组化染色的平均IOD值（×103）±＋s，n＝10）Tab.2 The average IOD values of immunohistochenical stains in the difference groups（×103）±＋s，n＝10）

表2 各组免疫组化染色的平均IOD值（×103）±＋s，n＝10）Tab.2 The average IOD values of immunohistochenical stains in the difference groups（×103）±＋s，n＝10）

注:与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与假手术组比较，★P＜0.05，★★P＜0.01.

组别 ColⅠ18.9±3.6模型组 16.8±4.7★★ 78.9±5.1★★雌激素组 24.7±3.8▲▲ 23.7±3.2▲▲木瓜低剂量组 21.4±4.1▲ 21.5±3.3木瓜高剂量组 25.6±3.0▲▲ 22.3±3.7 Cath L假手术组 26.5±3.1※▲

2.4 病理切片特征

右侧股骨用4%多聚甲醛溶液固定24h后用10%EDTA脱钙，常规石蜡包埋，取股骨髁部相同部位制成5μm厚的组织切片，HE染色，在光镜下观察各组切片组织病理学的变化.如图1所示:假手术组可见骨组织结构完整，骨小梁致密粗壮，数目多，形态规则，间隙适中，排列齐整；模型组，骨小梁稀疏，骨小梁间有断裂并且分离，间隙增大，排列紊乱，骨板层结构疏松，骨质疏松特征明显；雌激素组，骨小梁粗壮，结构完整，形态规则，骨小梁排列致密，且骨小梁数目明盟多于模型组；木瓜提取液高剂量组可骨小梁致密丰实，间距较窄，形态结构规整，宽度和间隙与假手术组和雌激素组接近.

图1 二仙汤对各组大鼠骨组织结构的影响Fig.1 The influence of Erxian decoction on bone structure

3 讨论

成骨细胞增殖阶段基因表达的ColⅠ是人体最丰富的胶原类型，约占骨基质的90%，它是构成骨的重要成分［4－5］.当纤维合成时，在特定蛋白的作用下使ColⅠ水解形成PINP，并释放入血，因此，血中PINP水平反映了胶原合成速率和成骨细胞的活性［6－7］.ICIP是一种成熟的也是唯一的交联物，是由ColⅠ降解时释放出的［8－9］，它以完整的免疫原性蛋白形式进入血液中，其与ColⅠ降解的比例为1∶1.因此，血清中ICTP是特异性很高的反映骨吸收的敏感指标.所以，联合检测血清中PINP和ICTP的水平直接反映了骨Ⅰ型胶原合成和降解状态［10］.本实验中，与模型组比较:木瓜组血清中的PINP水平显著升高（P＜0.05），木瓜高剂量组较低剂量组更为显著；而对于ICTP，木瓜组血清中的含量显著降低（P＜0.05）.由此可见，木瓜可以促进骨形成，同时抑制骨吸收，进而说明对去卵巢大鼠所致骨质疏松能起到重要的防治作用.

绝经后骨质疏松是老年妇女常患的一种代谢性骨病，患病率高［11］.雌激素水平的明显下降是导致骨质疏松的主要原因［12］.由于雌激素水平下降，减弱了对破骨细胞的抑制作用，破骨细胞破坏了骨小梁骨板层，导致骨小梁形成减少，骨小梁变窄，排列紊乱，从而影响骨形成和骨吸收的偶联，使成骨细胞凋亡增加［6］.

对骨质疏松症分子水平上的研究发现，破骨细胞溶酶体向骨小腔分泌组织Cath L，进而造成以ColⅠ为主要成分的骨支持蛋白分解亢进，成为导致骨质疏松症形成的重要因素之一，是骨吸收过程中的一个关键酶［13－14］.在本实验中，模型组的 Cath L活性明显提高，木瓜组及雌激素组Cath L活性明显降低，其中木瓜高剂量组与雌激素组无明显差异.

4 结论

本文研究结果表明，木瓜提取液通过降低破骨细胞Cath L的表达从而起到抑制去卵巢大鼠骨组织中成骨细胞ColⅠ蛋白的降解作用，进而增加骨小梁的数量，改善骨小梁的结构，降低骨的转换率，从而达到对绝经后骨质疏松预防的目的.本研究旨在为临床治疗绝经后骨质疏松，降低骨质疏松对机体的影响，从而为骨质疏松的防治提供新的思路和途径.

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