TNF-α 与IL-1β 对胃癌腹膜间皮细胞黏附分子mRNA表达的影响

梁 翙，丁健民，刘小宇

1.中国人民解放军第455 医院普通外科，上海200052； 2.上海第二军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室

目前，胃癌腹膜转移的机制尚未完全明确，但是相关研究表明，在适宜的局部微环境下，游离癌细胞与腹膜间皮细胞相互黏附是其发生的基础［1］。在众多影响肿瘤局部微环境的因素中，某些炎症因子与肿瘤发生、发展具有非常密切的关系，其中TNF-α 及IL-1β 是目前临床研究的热点。国内外一系列临床研究表明，TNF-α及IL-1β 表达于多种肿瘤的局部微环境中，且参与肿瘤生成、侵袭及转移等多个过程［2］。因此，本研究以体外原代培养人腹膜间皮细胞为研究对象，对不同浓度TNF-α 和IL-1β 处理下对腹膜间皮细胞与胃癌细胞黏附的影响进行检测分析，采用Real-time 法对腹膜间皮细胞经不同浓度TNF-α 及IL-1β 处理后，其黏附分子mRNA 的表达情况进行检测分析，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)正常大网膜组织。(2)主要试剂:TNFα 与IL-1β(购自北京邦定公司)，THERMOSCIPTTMRTPCR system(Gibco BRL)，Taq DNA 聚合酶(Promega)，10 mmol/L dNTP Mix(Gibco BRL)，PBS，戊二醛固定马红细胞(西格玛公司)。

1.2 方法 (1)人腹膜间皮细胞的分离、培养及鉴定:参考文献［3］中报道的方法。(2)炎症介质刺激人腹膜间皮细胞:首先将稳定培养的第1 代HPMCs 消化，然后使用DMEM/F12 培养基制成细胞悬浮液接种于带孔培养板中，于37 ℃及5% CO2浓度的培养箱中培养48 h。将上述培养的细胞分为两组，即TNF-α 处理组(无血清DMEM+不同浓度TNF-α)与IL-1β 处理组(无血清DMEM+不同浓度IL-1β)。两组pH 相同，且根据培养基体积大小加入浓度为5%的FBS。继续培养24 h 后将总RNA 进行提取，并收集上清液［4］。

1.3 逆转录反应(RT) 逆转录反应为20 μl，具体反应体系包括:模板RNA(3 μl)、5 ×Buffer(4 μl)、DTT(2 μl)、dNTP(1 μl)、Oligo dT(1 μl)、MMLV(1 μl)以及0.1%的DEPC 处理水(8 μl)。将以上试剂加入经DEPC 处理后的0.2 ml 的EP 管之中，快速离心混匀(离心率为3 000 r/min)，于PCR 仪中37 ℃条件下反应1 h，于95 ℃条件下灭活MMLV 约5 min，并于4 ℃条件下保存2 h［5］。

1.4 Real-time PCR 扩增反应

1.4.1 引物设计:Real-time PCR 扩增反应的引物设计如表1 所示。VCAM-1 产物最大。

表1 Real-time PCR 扩增反应的引物设计Tab 1 The designing table of Real-time PCR amplification reaction

1.4.2 Real-time PCR 反应:反应体系为20 μl，具体包括:SYBR GREEN SUPER-MIX(10 μl)、上下游引物(2 μl)、ROX-2(0.4 μl)、模板cDNA(2 μl)及灭菌蒸馏水(5.6 μl)。将上述体系按照次序加入到0.2 ml的EP 管中，于水浴上进行，经1 min 离心(离心率3 000 r/min)之后进行PCR 扩增反应。

1.5 统计学处理 采用SPSS 15.0 软件对数据进行统计分析，计量资料以x-± s 表示，采用t 检验;P ＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同TNF-α 处理浓度下黏附分子ICAM-1、VCAM-1 及CD44 mRNA 的表达情况 随着TNF-α处理浓度的逐渐增大，黏附分子ICAM-1、VCAM-1 及CD44 mRNA 的表达水平也随之升高，且与对照组比较差异均具有统计学意义(P ＜0.05，见表2)。

2.2 不同IL-1β 处理浓度下黏附分子ICAM-1、VCAM-1 及CD44 mRNA 的表达情况 随着IL-1β处理浓度的逐渐增大，黏附分子ICAM-1、VCAM-1 及CD44 mRNA 的表达水平也随之升高，且与对照组比较差异均具有统计学意义(P ＜0.05，见表3)。

2.3 胃腺癌细胞株中不同黏附分子mRNA 表达情况

经Real-time PCR 方法检测结果显示，人胃腺癌细胞株AGS、SGC-7901 及MKN-45 中的黏附分子LFA-1、VLA-4 及CD44 mRNA 均呈阳性表达(见表4)。

表2 不同TNF-α 处理浓度下黏附分子ICAM-1、VCAM-1 及CD44 mRNA 的表达情况(x- ±s)Tab 2 Adhesion molecules ICAM-1，VCAM-1 and CD44 mRNA expression after different concentrations of TNF-α treatment ( ±s)

表2 不同TNF-α 处理浓度下黏附分子ICAM-1、VCAM-1 及CD44 mRNA 的表达情况(x- ±s)Tab 2 Adhesion molecules ICAM-1，VCAM-1 and CD44 mRNA expression after different concentrations of TNF-α treatment ( ±s)

注:与对照组相比，* P ＜0.05。

组别ICAM-1 mRNA VCAM-1 mRNA CD44 mRNA对照组0.60 ±0.03 0.22 ±0.01 0.13 ±0.01 TNF-α 处理组1 ng/ml 0.77 ±0.04* 0.32 ±0.02* 0.22 ±0.03*5 ng/ml 0.95 ±0.06* 0.44 ±0.03* 0.39 ±0.02*10 ng/ml 1.35 ±0.07* 0.99 ±0.05* 0.78 ±0.03*

表3 不同IL-1β 处理浓度下黏附分子ICAM-1、VCAM-1 及CD44 mRNA 的表达情况(x- ±s)Tab 3 Adhesion molecules ICAM-1，VCAM-1 and CD44 mRNA expression after different concentrations of IL-1β treatment(x- ±s)

表4 不同人胃腺癌细胞株中CD44、VLA-4 及LFA-1 mRNA的表达情况(x- ±s)Tab 4 CD44，VLA-4 and LFA-1 mRNA expression in different human gastric cancer cell lines (x- ±s)

3 讨论

近年来，我国胃癌发病率呈逐年上升趋势，其死亡率较高，居恶性肿瘤第二位［6］。目前，临床上普遍认为导致胃癌患者病死的主要原因是胃癌术后癌细胞在腹膜中的转移。按照肿瘤“种子-土壤“学说，胃癌腹膜转移主要包括如下环节［7］:(1)胃癌细胞从原发病灶脱落;(2)腹腔中游离的胃癌细胞与腹膜间皮细胞发生黏附作用;(3)胃癌细胞突破腹膜间皮屏障进入间皮下基质。其中胃癌腹膜种植转移的基础为腹腔内游离的癌细胞能否与腹膜间皮细胞发生黏附作用。

目前，临床研究认为影响胃癌术后腹腔粘连形成的主要因素包括［8］:(1)急性炎症反应;(2)纤维蛋白出现溶解;(3)金属蛋白酶及其抑制剂。当腹部受到外界创伤如手术刺激，则首先会出现应激反应，其中最常见的一种是产生急性炎症反应，然后腹腔内的多种炎性细胞及间皮细胞会产生炎症因子，而这些炎症因子能够随腹膜液在腹腔中进行自由地流动，因此这些炎症因子对腹腔内黏附分子形成的影响具有十分重要的作用。目前，研究较多的炎症因子为TNF-α 和IL-1β。相关研究［9］表明，TNF-α 与IL-1β 可通过巨噬细胞以及中性粒细胞向创伤处进行转移，从而促进了纤维蛋白交联以及胞外基质重塑，利于创伤的迅速愈合。而这些炎症因子是否会促进腹腔内游离的胃癌细胞与腹膜组织之间发生黏附作用，目前临床报道较少。

肿瘤坏死因子(TNF-α)，也可称之为“恶病质素”，属于肿瘤坏死因子超家族的一种原型配体，具有众多功能，在细胞炎症反应以及凋亡过程中具有十分重要的作用。TNF-α 可通过上调内皮细胞表达白细胞黏附分子(LAM)而促进炎症细胞发生浸润，且能够对吞噬细胞的杀伤机制具有一定的活化作用，因此，TNF-α 在预防腹腔感染中具有十分重要的作用。近期，大量研究表明，TNF-α 参与肿瘤相关的炎症反应，且具有促进肿瘤细胞生长的作用［10］。Rani 等［11］近期研究表明，TNF-α 能够通过激活NF-κB 通路而具有促进肿瘤细胞增殖以及逃避杀伤等方面的作用。同时，Kulbe 等［12］研究表明，TNF-α 具有通过上调细胞趋化因子CXCR4 及ICAM-1 的表达而促进肿瘤的侵袭与转移。本研究结果表明，随着TNF-α 处理浓度的逐渐增大，黏附分子ICAM-1、VCAM-1 及CD44 mRNA 的表达水平也随之升高，且与对照组比较差异均具有统计学意义(P ＜0.05)。

IL-1β 是IL-1 的一个亚型，主要由单核细胞以及巨噬细胞所产生，其他来源包括NK 细胞、血小板、内皮细胞、巨核细胞以及中性粒细胞等。目前研究表明，IL-1β 能够提高对巨噬细胞等其他炎性细胞产生刺激性作用而介导多种炎症因子的分泌，其中最常见的有IL-6 与IL-10 等。同时，它还可以通过诱导毛细血管内皮细胞分泌化学性趋化因子(MCP-1)来促进内皮细胞对多种黏附分子加以表达，例如ICAM-1、VCAM-1以及E-选择素等。此外，IL-1β 还具有诱导细胞基质金属蛋白酶(MMPs)表达等方面的作用。ICAM-1 及MMPs 等蛋白在肿瘤细胞的侵袭及转移过程中均具有十分重要的作用，因此，本研究结果表明IL-1β 与肿瘤的侵袭、转移过程关系密切。

综上所述，炎症因子促进胃癌腹腔转移的可能机制为:炎症因子TNF-α 与IL-1β 通过提高人腹膜间皮细胞黏附分子ICAM-1、VCAM-1 及CD44 mRNA 的表达水平促进胃癌细胞与腹膜间皮细胞之间相互黏附，在胃癌细胞腹腔种植转移中发挥正性促进作用。

［1］ Zhu YH，Li C，Hu YL，et al. Analysis of endoscopic and clinicopathological fbatures of superficial spreading type of early gastric cancer［J］. Chin J Gastroenterol Hepatol，2012，21(1):17-20.朱燕华，李晨，胡月亮，等. 浅表扩散型早期胃癌的内镜及临床特点分析［J］.胃肠病学和肝病学杂志，2012，21(1):17-20.

［2］ Wu YL，Wu W，Xu B，et al.Clinical research of leak detection of gastric cancer by endoscopy［J］. J Intern Med Concepts Pract，2010，5(3):238-239.吴云林，吴巍，许斌，等.胃镜胃癌检漏的临床研究［J］. 内科理论与实践，2010，5(3):238-239.

［3］ Guo QM，Ye RG，Huang LH，et al. Hyaluronan synthase -2 in human peritoneal mesothelial cells and extracellular matrix synthesis of hyaluronic acid effect on the formation［J］. Chin J Nephrol，2002，18(5):331-336.郭群美，叶任高，黄凌虹，等.透明质酸合成酶-2 在人腹膜间皮细胞透明质酸合成及胞外基质形成中的作用［J］. 中华肾脏病杂志，2002，18(5):331-336.

［4］ Wu YL. Construction of early gastric cancer research from disciplinegroup［J］. J Intern Med Concepts Pract，2006，1(1):61-63.吴云林.早期胃癌研究必须从学科群建设抓起［J］. 内科理论与实践，2006，1(1):61-63.

［5］ Li C，Wu YL，Zhu YH，et al. The research on proportion of depressed type in early gastric cancer［J］. Chin J Gastroenterol Hepatol，2012，21(1):21-24.李晨，吴云林，朱燕华，等. 早期胃癌中凹陷型比率的临床分析［J］.胃肠病学和肝病学杂志，2012，21(1):21-24.

［6］ Hurlstone DP，Kiesslich R，Thomson M，et al. Confocal chromoscopic endomicroscopy is superior to chromoscopy alone for the detection and characterisation of intraepithelial neoplasia in chronic ulcerative colitis［J］.Gut，2008，57(2):196-204.

［7］ Yu G，Tang B，Yu PW，et al. Contents of IL-1β in peritoneal lavage fluid in laparoscopy-assisted and open gastrectomy for gastric cancer and its influence on the adhesion of peritoneal mesothelial cells to gastric cancer cells［J］. Med J Chin PLA，2010，35(1):28-31.于歌，唐波，余佩武，等. 腹腔镜与开腹胃癌手术腹腔冲洗液中IL-1β 浓度的变化及其对腹膜间皮细胞与胃癌细胞黏附的影响［J］.解放军医学杂志，2010，35(1):28-31.

［8］ Bo T，Zhihong P，Peiwu Y，et al. General complications following laparoscopic-assisted gastrectomy and analysis of techniques to manage them［J］. Surg Endosc，2009，23(8):1860-1865.

［9］ Rusai K，Huang H，Sayed N，et al. Administration of interleukin-1 receptor antagonist ameliorates renal ischermia-reperfusion injury ［J］.Transpl Int，2008，21(6):572-580.

［10］ Chen CX，Yu YH，Huang QM. The relationship between transform ing growth factor beta 1 gene polym orphism and gastric cancer with Helicobacter pylori infection ［J］. Chin J Gastroenterol Hepatol，2010，19(3):202-205.陈出新，余玉红，黄巧梅. TGF-β1-509C/T 基因多态性与胃癌幽门螺杆菌感染的相关性［J］. 胃肠病学和肝病学杂志，2010，19(3):202-205.

［11］ Rani S，Suri P，Shishodia PK，et al. Synthesis of nanocrystalline ZnO powder via sol-gel route for dye-sensitized solar cells［J］. Solar Energy Materials and Solar Cells，2008，92(12):122-128.

［12］ Kulbe N，Hoefft O，Ulbrich A，et al. Plasma electrochemistry in 1-Buty1-3-methylimidazolium di cyan amide:Copper Nanoparticles from CuCl and CuCl2［J］. Plasma Processes and Polymers，2011，8(1):32-37.