乳酸菌苯乳酸的合成及其代谢调控机制研究进展*

芦夏霏，刘毕琴，柳陈坚，李晓然，罗义勇

(昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明，650500)

乳酸菌(LAB)是一类可发酵碳水化合物，并产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌，是传统发酵食品的主要菌群，长期定居于人类肠道中并且益于人体健康，被公认为食品级安全的微生物。苯乳酸(PLA)是近年来发现的一种具有广谱抑菌性的新型生物防腐剂，不仅能有效抑制革兰氏阴性和阳性细菌的生长，对真菌同样具有抑制作用［1］。目前，市场上的食品防腐剂种类繁多，按来源可分为化学防腐剂和天然防腐剂两大类。天然防腐剂具有较高的安全性，是防腐剂未来的发展趋势。PLA作为一种新型的生物防腐剂可由LAB发酵产生，由于LAB是公认的食品级安全微生物，所以来源于LAB的PLA对人和动物细胞无毒害［2-3］，可以视为食品级安全的天然防腐剂。一般来说，PLA的产量主要取决于微生物的遗传特性，研究LAB高产PLA的分子机制以及通过代谢工程或基因工程手段改造实验菌株是获得大量PLA的前体条件。因此，本文综述了LAB PLA的代谢途径及其调控机制，旨在为PLA的高水平生产以及工业化利用提供理论支撑。

1 LAB PLA生物合成的核心途径

在生物合成途径发现以前，PLA多以化学合成为主。由于化学合成法存在副产物多、排放污染物多、设备要求高和合成技术复杂等缺点［1］，所以近年来，PLA的生物合成途径，特别是来源于LAB的生物合成途径受到了越来越多的关注。

Lavermicocca等［4］从酸面团中分离到植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)21B和20B，其代谢产物具有抑菌性。进一步研究证实，PLA是赋予该抑菌性的主要原因，这是关于LAB产生PLA的首次报道。随后，越来越多能产生PLA的LAB菌株相继被研究人员发现［5-6］。李兴峰等［7］研究了 Lb.sp.SK007 利用苯丙氨酸(Phe)合成PLA的过程，发现LAB首先通过转氨反应将Phe转化成苯丙酮酸(PPA)，然后PPA经还原反应生成PLA。以Lb.plantarum LY-78为研究对象，李士龙等［7］也证实了“Phe→PPA→PLA”途径是LAB PLA生物合成核心途径的重要组成部分。此外，越来越多的研究发现，α-酮戊二酸也是LAB PLA生物合成核心途径的一部分。同样以Lb.sp.SK007为实验材料，李兴峰等［8］对影响PLA合成途径中转氨反应的因素进行研究，确定氨基受体α-酮戊二酸是转氨反应的主要影响因素，只有Phe和α-酮戊二酸共同作用才可完成转氨反应。相似的发现存在于 Pudik和 Lolkema［9］的研究中，即 α-酮戊二酸是LAB PLA合成的关键因素，较高浓度的α-酮戊二酸有助于PLA的生成。所以，LAB PLA生物合成的核心途径是指LAB发酵Phe和α-酮戊二酸生成PLA的过程(图1 A)。

2 LAB PLA生物合成的相关途径

LAB PLA主要由Phe的代谢生成，除此之外还有一些其他的合成相关途径(图1 B)。刘凤丽和江波［10］在关于Lb.sp.SK007生物合成PLA的研究中，发现PPA在脱羧酶的作用下可以生成苯乙醛，苯乙醛在脱氢酶的作用下也可以生成PLA。利用KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库，对已知全基因组序列的Lb.plantarum WCFS1、JDM1和ST-III［11］进行PLA相关的代谢途径分析，发现酪氨酸经脱羧酶作用生成酪胺，酪胺可以在单胺氧化酶的作用下生成苯乙醛(图1B)，所以酪氨酸代谢可能通过苯乙醛这个节点对PLA代谢有一定影响。Gummalla和 Broadbent［12］为了确定 Lactobacillus代谢 Phe 对干酪风味的影响，利用色谱技术分析了Phe的代谢产物，结果发现PLA、苯甲酸、苯乙酸和苯丙酸是Phe的主要代谢产物。苯乙醛和苯乙酸有共同的代谢产物苯乙醇，所以“苯乙酸→苯乙醛→苯乙醇”是LAB PLA生物合成的相关途径之一。此外，基于α-酮戊二酸是LAB PLA生物合成核心途径不可或缺的部分［8-9］以及α-酮戊二酸是三羧酸循环(TCA)中的重要物质之一的背景知识，可以推测TCA途径对PLA的合成会产生一定的影响，所以TCA应该也是PLA生物合成的相关途径之一(图1 B)。

3 LAB PLA的分解代谢途径

LAB PLA产量的多少除了跟生物合成途径相关外，分解代谢同样具有重要影响。目前，关于LAB PLA分解代谢途径的研究较少，且缺乏系统性的研究。李远颂等［1］发现，PLA除了可以代谢为非蛋白氨基酸施德定(一种很有效的胃蛋白酶抑制剂)外，还可以直接转化为1-溴-2，3苯甲烷，再转化为2-苯基双氢苯并吡喃，最后转化为四氢噻唑二酮衍生物(图1 C)。另外，利用物理化学和色谱等分析方法，Wegst和Tittmann［13］在添加 Phe的无机盐培养基中分离和鉴定出了一种新的代谢产物——二氢化二醇，说明Lactobacillus可以将PLA转化为二氢化二醇(图1 C)。此外，利用生物信息学方法对KEGG数据库分析［14］得出苯乳酸还可以转化为苯乳酸CoA，而苯乳酸CoA还可以进一步降解为苯基甘氨酸和苯基谷氨酸2种物质(图1 C)。

图1 LAB PLA的代谢相关途径Figure 1 Metabolism related way of LAB PLA

4 LAB PLA代谢的调控研究

环境因素会对PLA的产生造成影响，在相同环境因素下，有些微生物产PLA的能力很强，而主要的合成途径基因在DNA水平没变化，这可能与PLA合成过程中存在着各种各样的调控相关。

4.1 影响PLA代谢过程的因素

4.1.1 温度和pH值

为了探究温度对LAB产PLA的影响，李兴峰等［8］测定了Lb.sp.SK007在不同温度下的生长量和PLA产量。结果发现，30℃是Lb.sp.SK007最适生长温度，PLA产量也最高。25℃菌体生长缓慢，37℃和43℃时菌体生长和PLA合成均受到抑制。相似的实验结果存在于李远颂等［1］的研究中，即30℃是LAB菌体生长和PLA合成的最佳温度。

每种微生物都有适合其生长和代谢物产量的最适pH。李兴峰等［15］发现培养基初始 pH在6.0～6.5时，Lb.sp.SK007的PLA产量最佳。王立梅［16］等在研究pH及底物浓度对副干酪乳杆菌(Lb.paracasei)产PLA的影响时，发现相似的实验结果，即发酵液pH在6.5时PLA产量最高。

4.1.2 培养方式

培养方式是影响发酵转化的另外一个重要因素。李兴峰等［8，15］分别选取静置发酵和振荡培养2种方式对Lb.sp.SK007产PLA水平进行研究，发现在实验室摇瓶条件下，振荡培养对菌体生长和PLA合成均不利，并且随着转速的增加，副产物也随之增加，说明在振荡培养条件下，可能是由于底物对氧气不稳定，部分PPA经脱羧反应产生了苯甲醛;而静置发酵更适合菌体生长［15］。由此可见，在发酵过程中应该选择静置培养，这样才会避免副产物的产生，为PLA的分离纯化减轻压力，使PLA的产量达到较高水平。

4.2 调控LAB PLA产生的关键因素

4.2.1 苯丙酮酸(PPA)和α-酮戊二酸的浓度

李兴峰和江波［8］研究了Lb.sp.SK007 PPA的代谢途径及其对PLA合成的影响，发现在30℃静止培养情况下，随着PPA浓度的增加，PLA的产量逐渐增加，达到18.3 mmol/L的顶峰后，PLA的产量逐渐下降，说明PPA的浓度在一定范围内对PLA的合成具有促进作用。α-酮戊二酸是LAB PLA生物合成核心途径的一部分(图1 A)，所以α-酮戊二酸浓度对PLA的合成有重要影响。Pudik和Lolkema［9］发现增加α-酮戊二酸浓度能显著提高PLA产量，Phe首先需要与 α-酮戊二酸结合后，才可被氨基转移酶(ATase)作用;而α-酮戊二酸与Phe的结合需要转运子CitP的作用。此外，α-酮戊二酸是TCA中的重要代谢终产物之一，所以CitP和TCA对LAB PLA产量应该具有间接调控作用。

4.2.2 乳酸脱氢酶(LDH)

LDH是LAB转化PPA生成PLA的一种关键酶。基因组序列分析发现，Lb.plantarum WCFS1具有3个LDH基因，其中1个为 ldhD，另外2个分别为ldhL1 和 ldhL2［17］。Mehemit等［18］分别研究了粪肠球菌(Enterococcus faecalis)ldhL1和ldhL2的生物学功能，发现在PLA高产菌株中，ldhL1的表达水平也高，而ldhL2基因缺失菌株的PLA产量基本不受影响。相似的结果也出现在贾江花和江波［7］的实验中:通过E.coli异源表达和纯化，发现重组酶D-LDH对底物PPA的活性最高，其次为L1-LDH，而L2-LDH几乎没有活力，说明D-LDH和L1-LDH是负责LAB PLA生物合成的主要LDH。

4.2.3 氨基转移酶(ATase)

Tokuda等［19］指出，ATase 主要作用 Phe，使 Phe转化为 PPA。以 Lb.sp.SK007为实验材料，Liu等［20］研究了Phe生成PLA过程，发现在最初的24 h中，Phe减少非常缓慢，并且PLA缓慢增加，检测不到中间产物PPA;培养72 h后，PLA浓度达到最高，但Phe仍剩余94%，表明只有6%的Phe发生了转氨反应，而生成的PPA迅速转化为PLA。因此，由ATase介导的转氨反应是Phe生成PLA的限速步骤，对PLA从Phe合成途径具有重要影响。此外，Phe转化为PPA效率不高的另外一个原因可能是由于该反应具有可逆性造成的。LI等［21］发现用 PPA取代 Phe作为底物，可以显著提高Lactobacillus PLA的产量，同时发现在PPA到PLA的转化过程中有少量Phe出现，说明一些PPA在ATase作用下可以转化为Phe。Chambellon等［22］从 Lactococcus lactis分离出，2 个氨基转移酶AraT和BcaT，它们分别负责芳香族氨基酸和支链氨基酸的转氨作用，并且证明araT和bcaT是codY调节子的一部分，由营养因子调控。

4.3 调控LAB PLA产生的其他因素

据报道，Phe不是十分稳定的，易分解为苯甲酸、苯乙酸和苯丙酸等代谢产物(图1 B)，并且苯乙酸还可以转化为苯乙醇［12，19］。由于Phe经转氨反应生产PPA的低效性［20］，所以由Phe经PPA生成PLA的反应过程应该不是Phe代谢的主要途径。PLA除了可以由PPA在LDH作用下直接生成外(图1 A)，还可以经“PPA→苯乙醛→PLA”途径间接产生(图1 B)。代谢学研究还发现，苯乙醛可以还原为苯乙醇(图1 B)。这样通过苯乙醇这个点就可以将Phe代谢、PPA代谢和PLA合成联系起来(图1)，在这个复杂的代谢网络中，各种化合物相互联系又相互抑制，因此LAB PLA的产生应该会受到这些化合物浓度的调控。

5 总结与展望

LAB PLA是近年来发现的一种新型食品级安全防腐剂，具有很广的抑菌谱。目前，关于LAB PLA的研究以抑菌性和生产条件的优化为主，对于PLA的代谢途径及其调控机制的研究相对较少，且主要集中在核心合成途径以及核心合成途径相关酶类对于PLA代谢的影响等方面。

在前期的研究中，我们从云南传统发酵豆制品——豆豉中分离鉴定了1株益生效果较好的Lb.plantarum YM-5-2。抑菌性研究发现，Lb.plantarum YM-5-2发酵上清液对大肠杆菌(E.coli)O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)等主要食源性病原菌具有很好的抑菌效果［23］。利用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)分析发现，Lb.plantarum YM-5-2发酵上清液中的主要化合物是PLA，且在没有任何发酵条件优化的条件下，PLA的产量高达147.91 mg/L［23］。目前，我们利用焦磷酸测序策略测定了Lb.plantarum YM-5-2的全基因组序列(结果未显示)，生物信息学分析发现，该菌种具有合成 PLA的关键基因(LDH、ATase等)。探讨Lb.plantarum YM-5-2高产PLA的分子机制是我们接下来要解决的问题。本文对LAB PLA的生物合成和分解代谢途径以及与该途径相关的调控机制做了一个系统性的归类和总结，不仅可以加深对PLA的代谢途径及其调控机制的理解，同时也可为食品级PLA的开发和利用提供理论基础。

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