苦荞茶多糖的体外抗氧化活性及其分离纯化*

杨红燕，严楠楠，姜艳红，杨兴斌

(陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安，710119)

苦荞(Fagopyrum tataricum(L.)Gaertn)是1种蓼科荞麦属双子叶植物，又名鞑靼荞麦(tartary buckwheat)，为1年生或多年生宿根性植物［1］。因其喜高寒，多生长在高寒山区，在我国具有悠久的栽培历史，品种资源丰富，苦荞现分布在我国西南和华北等地山区。苦荞茶是将苦荞的种子苦荞米经过筛选、烘烤等工序加工而成的冲饮品。大量的研究资料表明，苦荞茶在抗氧化、抗衰老、抗癌、增强人体免疫力等方面都具有很好的生理功能［2-4］，因此将其开发和推广具有很好的应用前景。目前，对于苦荞茶的研究大多集中在黄酮类物质和蛋白质上，对苦荞茶多糖的研究鲜见报道［1，5-7］。而天然的植物多糖具有重要的生物活性，能够增强机体的免疫机能，具有抗肿瘤、降血脂和血糖以及抗病毒等药理作用［8］。因此，苦荞茶多糖的研究有着重要的意义，它不仅能够阐明苦荞茶多糖的生理活性，而且为苦荞产品的进一步推广和应用提供重要的理论依据和指导。本研究采用四川凉山黑苦荞茶作为对象，利用水提醇沉方法获得TBTP，对其进行抗氧化研究，并对粗多糖进行分离纯化，用于进一步的生理活性研究。

1 试剂与仪器

1.1 实验试剂

黑苦荞茶，购至四川西昌市滋元食品有限公司;超纯水，实验室自制;HCl、NaOH、无水乙醇、乙醇体积分数(95%)、H2O2、抗坏血酸、FeSO4、Na2HPO4、NaH2PO4、FeCl3、［K3Fe(CN)6］、三氯乙酸(TCA)、水杨酸、三氯甲烷、氮蓝四唑(NBT)、还原型辅酶(NADH)和吩嗪甲硫酸盐(PMS)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、NaCl，均购自天津市天力化学试剂有限公司，为分析纯。

1.2 实验仪器

200 g多功能粉碎机，西安金振机械设备有限公司;标准检验筛(60目)，浙江上虞市道墟张兴纱筛厂;药物电子天平SL202N型，上海明桥精密科学仪器有限公司;HH-6B数显恒温水浴锅，杭州大卫科教仪器有限公司;LD4-2低速离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司;SHBⅢ循环水多用真空泵，上海比朗仪器有限公司;RE-2000A旋转蒸发器，杭州大卫科教仪器有限公司;透析袋，华美生物工程公司;超纯水仪，MILLI-Q MILLIPORE公司;冷冻干燥设备，EZDRY杭州大卫科教仪器有限公司;微量移液枪，大龙公司;3 cm×50 cm层析柱，上海华美实验仪器厂;BSZ-100自动部分收集器，上海泸西分析仪器厂有限公司;全波长酶标仪，美国热电公司;KQ-300DE型数控超声波清洗器，宁波新芝生物科技股份有限公司。

2 实验方法

2.1 TBTP的提取及测定

2.1.1 TBTP 提取工艺流程［9］

苦荞茶→粉碎→脱脂→热水提取→离心收集上清液→浓缩水提液→醇沉→除蛋白→透析→冷冻干燥→TBTP

2.1.2 TBTP多糖含量的测定

TBTP测定采用改进的苯酚-硫酸法［10］。精确称取干燥至质量恒定的葡糖糖标准品10 mg，用蒸馏水定容至100 mL容量瓶，摇匀，稀释配制质量浓度分别为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL 的标准溶液，各取1 mL并加入5%苯酚溶液1 mL，再加5 mL浓H2SO4，混合均匀后，室温放置30 min，在490 nm波长处测定吸光度，以蒸馏水按照同样显色操作为空白，绘制标准曲线。

2.2 TBTP体外抗氧化活性的测定

2.2.1 对DPPH·清除能力测定

本实验参照何念武等［11］报道的方法稍作修改，评价TBTP对DPPH·的清除能力。将3 mL DPPH(1 mmol/L)甲醇溶液与1 mL不同浓度的样品溶液分别加入试管中，充分混合，黑暗处理30 min，在517 nm处测定吸光值。VC作阳性对照，用蒸馏水代替多糖溶液作阴性对照，用甲醇代替DPPH做本底组对照。清除率按以下方法计算:

其中:Aa为样品吸光值，Ab为样品本底吸光值，A0为阴性对照值。

2.2.2 ·OH的清除能力测定

利用Fenton体系法测定多糖对·OH的清除能力［12-14］。Fenton 反应中 FeSO4与 H2O2反应产生·OH。·OH具有较高的反应活性，存活时间短。水杨酸能够有效捕捉·OH并产生有色物质，该物质在510 nm处有强吸收峰。在反应体系中加入具有能清除·OH的物质，可以减少有色物质的生成。故可以通过在510 nm处测定吸光值的变化来测定该物质的清除·OH的能力，从而判断其抗氧化能力。往10 mL离心管中依次加入1 mL多糖溶液，1 mL FeSO4(6 mmol/L)溶液，1 mL水杨酸-乙醇(6 mmol/L)溶液和1 mL H2O2(6 mmol/L)溶液，于37℃水浴1 h，然后在510 nm处测定吸光值。用蒸馏水代替多糖溶液作阴性对照，用蒸馏水代替H2O2溶液作本底对照。清除率的计算:

其中:Aa为样品吸光值，Ab为样品本底吸光值，A0为阴性对照值。

2.2.3 O2-·的清除能力测定

本实验参照 Tian 等［15］、吕喜茹等［16］报道的方法进行，测定苦荞多糖对O2-·的清除能力。在NADHPMS-NBT体系中，NADH与 NBT反应产生O2-·，O2-·与PMS结合生成的化合物显色并在560 nm处具有最大吸光值。抗氧化能力越强，对O2-·的清除能力就越强，吸光值就越小。往试管中依次加入1 mL NBT(0.078 mol/L)溶液，1 mL NADH(0.468 mol/L)溶液，1 mL不同浓度的多糖溶液，0.4 mL PMS(0.06 mol/L)溶液，充分混匀，静置5 min，在560nm处测其吸光值。用蒸馏水代替多糖溶液作阴性对照，蒸馏水代替PMS作本底组对照，VC作阳性对照。清除率计算:

其中:Aa为样品吸光值，Ab为样品本底吸光值，A0为阴性对照值。

2.2.4 TBTP总还原能力的测定

参照Kirigaya Norimasa［17］提供的方法对TBTP的总还原能力做评价。取1 mL多糖溶液，加入2.5 mL磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L，pH 6.6)，2.5 mL K3Fe(CN)6溶液(1%)，充分混合，50℃水浴 20 min，然后加入2.5 mL的 TCA(0.1 mg/mL)混匀，3 000 r/min离心10 min，取上清液2 mL，放入另一支试管中，依次加入2 mL蒸馏水和0.5 mL FeCl3(0.1%)，混匀，室温静置10 min，然后于700 nm处测定吸光值。VC作阳性对照，用蒸馏水代替0.1%FeCl3溶液作本底对照。

2.3 TBTP的分离纯化

2.3.1 DEAE-52纤维素预处理

DEAE-52纤维素为亲水弱碱性阴离子交换剂。称取DEAE-52纤维素树脂100 g预处理，在25℃蒸馏水中浸泡24 h，使其充分溶胀。再用双蒸水反复洗涤，去除纤维素单体或碎片的悬浮颗粒，抽干，用0.5 mol/L NaOH溶液500 mL浸泡30 min，适当搅拌后，用双蒸水洗至中性;再用0.5 mol/L HCl溶液500 mL浸泡30 min，适当搅拌后，用双蒸水洗至中性;最后用0.5 mol/L NaOH溶液500 mL浸泡30 min，适当搅拌后，用双蒸水洗至中性。抽干，备用。

装柱与平衡:将预处理好的DEAE-52纤维素树脂加适量双蒸水，搅拌，用超声脱气2 h后，沿玻璃棒小心缓慢1次灌到3 cm×50 cm层析柱，同时轻轻敲击柱壁，使填料沉降均匀、致密，柱高40 cm，静态沉降24 h，使层析柱达到平衡状态，用于粗多糖的分离纯化［18］。

2.3.2 TBTP DEAE-52纤维素层析柱纯化

称取TBTP 0.3 g，溶解于10 mL双蒸水，离心，上清液经0.45 μm微孔滤膜过滤后上样，用NaCl溶液进行梯度预洗脱，带刻度的试管收集，每管收集6 mL，收集液隔管用苯酚-硫酸法跟踪检测，在484 nm的波长下测定吸光度。以管号为横坐标，各管吸光值为纵坐标，绘制洗脱曲线，选择其中洗脱效果明显的NaCl浓度，在该浓度条件下重复洗脱，保留尖峰管，分别合并其他各洗脱浓度下的洗脱液，减压浓缩，透析72 h，冷冻干燥得到粗多糖的初级分离组分［19］。

2.3.3 TBTP G-150葡聚糖凝胶层析柱纯化

葡聚糖凝胶是一种珠状的凝胶，含有大量的羟基，很容易在水中和电解质溶液中溶胀。称取G-150葡聚糖凝胶25 g，1 000 mL去离子水浸泡2d，使其充分溶胀，倾去上层液，并反复洗涤，除去悬浮物及其他杂质。用抽滤瓶抽气的方法排气1 h，以排空凝胶中的空气。将收集到的DEAE-52柱层析中的峰面积较大的组分用G-150葡聚糖凝胶柱层析进一步纯化。上样量为30 mg，上样体积为5 ml，流速为0.5 mL/min，以去离子水为洗脱剂洗脱，分布收集器进行分部收集，6 ml每管，苯酚-硫酸定糖法测定多糖含量。以试管号为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制洗脱曲线。保留尖峰管，合并洗脱峰的洗脱液，减压蒸馏，冷冻干燥。

3 结果与分析

3.1 TBTP含量测定

以葡萄糖标准浓度为横坐标，其对应吸光值为纵坐标作葡萄糖标准曲线，建立回归方程。得到其标准曲线如图1所示。

图1 多糖含量标准曲线图Fig.1 The standard curve of polysaccharide content

由图1和表1可知，当粗多糖浓度0.08 mg/mL时的吸光度为0.142，代入葡萄糖标准曲线中计算得多糖含量为58.75%。

表1 样品多糖含量测定Table 1 Determination of samples polysaccharide content

3.2 对DPPH·清除能力

由图2可知，TBTP有明显的清除DPPH·的能力，且表现出良好的剂量效应关系，随着浓度的增加，清除率越高。在浓度为8 mg/mL时，TBTP对DPPH·的清除能力达到94.16%，与VC的清除能力相当，且无显著性差异。同时，当多糖的浓度为3 mg/mL时，板栗多糖的清除率不到40%［20］，而TBTP的清除率已高达60%。由此可见，作为食源物质，TBTP具有明显的清除DPPH·的能力。

图2 TBTP对DPPH·的清除率Fig.2 DPPH radical-scavenging activity of TBTP

3.3 对·OH的清除能力

图3 TBTP对·OH的清除率Fig.3 Hydroxyl radical-scavenging activity of TBTP

由图3可知，TBTP清除·OH的能力随着浓度的增大而增强，表现出良好的剂量效应关系，在相同浓度下TBTP对·OH的清除率低于VC，但在10 mg/mL时，清除率为83.22%，而在此多糖浓度时，黄瓜多糖的清除率为 55%［11］，比 TBTP的清除率低28.22%，表明苦荞茶与其他食源性物质相比，其多糖对·OH很好的清除能力。

3.4 对O2-·的清除能力

由图4可知，TBTP能高效的清除O2-·，清除能力随着浓度的增大而增强，尽管在相同浓度下TBTP对O2-·的清除率低于VC，但在高浓度时其清除能力接近于VC。在4 mg/mL时，TBTP对O2-·的清除率达到98.05%，是黄瓜多糖3倍［11］，且与VC无显著性差异，表明TBTP对O2-·有很好的清除能力。

图4 TBTP对O2-·的清除率Fig.4 Superoxide radical-scavenging activity of TBTP

3.5 TBTP的总还原能力

由图5可知，在实验浓度范围内，TBTP还原力测试混合液的吸光值随着浓度的增大而增大，当浓度为20 mg/mL时，TBTP溶液的吸光值达到0.61，虽与VC具有一定的差距，但可以说明TBTP有一定的总还原能力。

图5 TBTP的总还原能力Fig.5 Iron(III)to iron(II)reducing power of TBTP

3.6 TBTP的DEAE-52纯化结果

综合考察以上TBTP体外抗氧化指标可知，作为食源性物质，TBTP的抗氧化活性相对偏高，具有广阔的潜在利用价值，故将对其进一步的分离纯化，明确其组成，为苦荞的进一步推广和应用提供重要的理论依据和指导。如图6所示为TBTP经DEAE-52柱层析的结果。洗脱液分别采用 0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.5 mol/L NaCl溶液梯度洗脱，得到3个单一峰。0、0.1、0.2、0.5 mol/LNaCl溶液洗脱得到的组分极少，几乎没有洗脱峰。其中0.05、0.15、0.3 mol/LNaCl浓度溶液洗脱峰面积最大，为主要洗脱峰。所以仅对0.05、0.15和0.3 mol/LNaCl洗脱液洗脱所得组分进一步纯化，做深入研究。收集0.05、0.15、0.3 mol/LNaCl洗脱液洗脱部位，减压蒸馏，透析(分子截留量10 000 Da)3d，每天换水4次，冷冻干燥，得组分 TBTP-1、TBTP-2、TBTP-3。

图6 TBTP的DEAE-52柱层析图Fig.6 Eluting curve of TBTP on DEAE-52 column

3.7 TBTP的G-150葡聚糖凝胶纯化结果

对TBTP DEAE-52柱层析纯化得到较多的组分(TBTP-1、TBTP-2、TBTP-3)进行 G-150葡聚糖凝胶层析柱纯化，结果如图7～图9所示。

由图7～图9可知，DEAE-52柱层析纯化后的G-150葡聚糖凝胶柱层析得到的都为均一的峰，说明0.05、0.15和0.3 mol/LNaCl洗脱 DEAE-52纤维素柱层析得到组分为均一多糖，并分别命名为TBTP-1、TBTP-2和 TBTP-3。

图7 0.05 mol/LNaCl洗脱组份G-150葡聚糖凝胶柱层析图Fig.7 Elution curve of 0.05 mol/L NaCl eluting component on Sephadex G-150 column

图8 0.15 mol/LNaCl洗脱组份G-150葡聚糖凝胶柱层析图Fig.8 Elution curve of 0.15 mol/L NaCl eluting component on Sephadex G-150 column

图9 0.3 mol/LNaCl洗脱组份G-150葡聚糖凝胶柱层析图Fig.9 Elution curve of 0.3 mol/L NaCl eluting component on Sephadex G-150 column

4 结论

(1)水提醇沉法获得TBTP，通过苯酚-硫酸法测定苦荞多糖含量，做标准曲线，得其多糖含量为58.75%。

(2)TBTP对 DPPH·、·OH、O2-·有较好的清除能力，TBTP总还原能力一般。但是随着多糖溶液浓度的增加，3种自由基的清除能力和还原能力都相应增加。在质量浓度为8.0 mg/mL时，对DPPH·的清除率为94.16%，对·OH的清除率为82.25%;在质量浓度为4.0 mg/mL时，对 O2-·的清除率为98.05%。

(3)用纤维素和葡聚糖凝胶分离纯化，得到3个均一多糖分离组分，分别为TBTP-1、TBTP-2、TBTP-3。

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