1株分离自西沙诺尼果原浆细菌菌株CICC 10881的鉴定及生物学特性研究*

张欣，刘洋，姚粟，曹艳花，翟磊，苏姣姣，谭望桥，程池

1(中国食品发酵工业研究院中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京，100015)

2(海南诺尼生物工程开发有限公司，海南海口，570125)

诺尼(Morinda citrifolia L.)，又称为海巴戟天，是一种生长于热带、亚热带的茜草科植物，原产于亚洲、澳大利亚及一些太平洋岛屿，在我国主要分布于海南西沙群岛。诺尼的食用历史悠久，营养丰富且具有非常广泛的保健功效和药用价值，如抗菌消炎、增强免疫力等［1-5］。诺尼果原浆是西沙诺尼果经洗净、放置后熟、打浆，未经过滤和灭菌而制成的。因其最大限度地保留了诺尼的营养成分，因而更有利于人体的吸收，并发挥其应有的保健功效。

本研究以西沙诺尼发酵果原浆中分离筛选得到的1株优势菌株CICC 10881为研究对象，利用16S rRNA和16S-23S rRNA基因条形码序列(Bar-Coding)对其进行分类学鉴定，并对其生长条件进行初步研究，旨在为进一步了解其生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

供试菌株分离自西沙诺尼发酵果原浆样品(由海南诺尼产业园开发有限公司提供)，并保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，保藏编号为CICC 10881。

1.1.2 培养基

LB、NB、R2A、MRS、TSB 培养基均购自北京陆桥技术有限责任公司。

DSM989培养基(蛋白胨 0.5%、酵母浸粉0.5%、葡萄糖0.5%、MgSO4·7 H2O 0.1%);GY培养基(酵母浸粉1%、葡萄糖5%)。

1.1.3 主要试剂

Taq DNA聚合酶、dNTP、DL 2000 Marker均购自天根生化科技有限公司;GoldView购自北京塞百盛基因技术有限公司;溶菌酶购自Sigma公司、蛋白酶K购自Merk公司;API 20E、API 50CH试剂条购自法国梅里埃公司;其他化学药品均为进口分析纯产品。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株分离

在无菌条件下吸取10 mL诺尼发酵果原浆于盛有90 mL无菌水的三角瓶中，充分振荡混匀。采用梯度稀释法制备10-2～10-6的系列稀释液，分别涂布到MRS培养基中置于30℃下培养48 h。挑取单菌落转接到新鲜的MRS斜面培养后于4℃保藏。

1.2.2 形态学观察

将供试菌株接种于MRS固体培养基，置于30℃培养48 h后，观察其在MRS培养基上的菌落形态特征;并利用光学显微镜及电子显微镜进行菌体形态特征观察［6］。

1.2.3 生理生化特征API检测

采用API 20E及API 50CH试剂条对CICC 10881的酶活性、碳源利用及其产酸情况等生理生化特征进行检测，具体操作方法按试剂条使用说明书。

1.2.4 16S rRNA基因序列分析

利用细菌基因组DNA提取试剂盒(Tiangen公司)提取菌株CICC 10881基因组DNA。采用刘洋等［7］的方法以基因组DNA为模板，扩增16S rRNA基因序列并用ABI 3700基因测序仪测序。测序由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。测序结果在EzBioCloud数据库中进行比对［8］，用CLUSTAL W对CICC 10881及其若干近缘种16S rRNA基因序列进行多序列比对［9］，并利用N-J法通过MEGA 5软件进行系统发育分析［9］。

1.2.5 16S-23S rRNA基因序列分析

以菌株CICC 10881基因组DNA为模板，利用16S-23S rRNA基因序列的特异性引物及条件进行PCR扩增［10-11］。产物用ABI 3700基因测序仪测序，测序得到的结果在GenBank数据库中进行比对。

1.2.6 培养条件研究

1.2.6.1 培养基对菌株CICC 10881生物量的影响

将菌株分别接种于LB培养基、营养肉汤培养基、R2A、DSM989、MRS、TSB 培养基中，30℃ 200 r/min振荡培养24 h，取1 mL培养液12 000 r/min离心5 min，弃上清液，用200 μL无菌水重悬后，测定600 nm处的吸光度值，确定最佳培养基。

1.2.6.2 温度对菌株CICC 10881生物量的影响

将菌株接种于 MRS培养基中，分别在25、30、35、42℃，转速200 r/min下振荡培养24 h后，分别取1 mL培养液12 000 r/min离心5 min，弃上清液，用200 μL无菌水重悬后，测定600 nm处的吸光度值，确定最佳温度。

1.2.6.3 初始pH值对菌株CICC 10881生物量的影响

将MRS培养基初始pH值分别调整至4.5、5.5、6.5、7.5、8.5，在 30℃，转速200 r/min 下振荡培养24 h后，分别取1 mL培养液12 000 r/min离心5 min，弃上清液，用200 μL无菌水重悬后，测定600 nm处的吸光度值，确定培养基最佳pH值。

2 结果

2.1 形态学观察

菌株CICC 10881在MRS培养基上菌落较小，呈浅黄色，圆形，边缘整齐，表面光滑并凸起(见图1a);利用光学显微镜观察显示菌体细胞呈椭圆或短杆状，革兰氏阴性，单个或成对排列(见图1b)。菌体电子显微镜观察菌体呈圆端短杆，长度1.0～1.5 μm，宽度0.6～0.8 μm，扫描电镜成像效果见图1c。

图1 菌株CICC 10881形态学观察结果Fig.1 Morphological observation of strain CICC 10881

2.2 生理生化结果

菌株CICC 10881的酶活性、碳源利用及其产酸情况等生理生化特征结果详见表1。结果显示，菌株CICC 10881接触酶反应阳性，不液化明胶;能利用D-葡萄糖、D-木糖产酸，不能利用L-阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、淀粉、甘露醇、N-乙酰葡糖胺、蔗糖等碳源物质;生理生化结果符合醋杆菌属(Acetobacter sp.)的特征。

2.3 16S rRNA基因序列分析

菌株CICC 10881的基因组DNA提取结果见图2，所提取的DNA片段约为23.1kb，利用引物27f和1492r扩增得到16S rRNA基因全长序列，结果显示，PCR产物仅有一条带，大小约为1500 bp(见图3)。扩增产物经测序及分析处理后，将序列信息提交至GenBank，登录号为 KJ934259。以 Escherichia coli KCTC 2441T(EU014689)为外群，构建CICC 10881与相关近缘模式菌株的系统发育树(图4)。由系统发育分析确定菌株CICC 10881归属为醋杆菌属(Acetobacter sp.)。

表1 CICC 10881生理生化特征API检测结果Table 1 API test of strain CICC 10881

图2 CICC 10881基因组DNAFig.2 CICC 10881 genomic DNA

图3 CICC 10881 16S rRNA基因扩增产物Fig.3 CICC 10881 16S rRNA gene PCR amplication

图4 CICC 10881 16S rRNA基因系统发育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of CICC 10881 16S rRNA gene

2.4 16S-23S rRNA基因序列分析

以菌株CICC 10881的基因组DNA为模版，利用特异性引物(its1/its2)扩增菌株16S-23S rRNA基因序列，产物经测序及分析处理后，将序列信息提交至GenBank，登录号为KJ934261。将序列在GenBank中进行Blast比对，与东方醋杆菌(Acetobacter orientalis)的16S-23S rRNA基因序列的相似性为99%，与醋杆菌属中的其他近缘种的相似性均低于95%。图5为以Gluconobacter oxydans DSM 3503T(AJ007763)为外群，构建CICC 10881与相关近缘模式菌株的系统发育树。由系统发育分析确定菌株CICC 10881被鉴定为东方醋杆菌(Acetobacter orientalis)。

2.5 菌株CICC 10881分类鉴定结论

通过形态学观察，生理生化鉴定，16S rRNA基因序列系统发育分析及16S-23S rRNA基因序列的比对分析，分离自海南西沙诺尼发酵果原浆样品中的菌株CICC 10881被鉴定为东方醋杆菌(Acetobacter orientalis)。

图5 CICC 10881 16S-23S rRNA基因序列系统发育分析Fig.5 Phylogenetic analysis of CICC 10881 16S-23S rRNA gene

2.6 菌株最适生长条件

培养基、初始pH值、温度对菌株生物量的影响见图6。菌种在6种培养基中均能生长，NB、TSB、MRS培养基更有利于菌体生长，以MRS培养基为最佳。温度和初始pH值对菌株生物量的影响很大;30℃时菌体生物量达到最大值，低于30℃，菌体生长缓慢，而超过35℃菌体生长趋于停滞;初始pH值在4.5～6.5菌体均生长良好，pH5.5时菌体量达到最大值，碱性条件菌体生长受到抑制，可见酸性条件下更适宜菌体生长。因此，菌株的最适培养基为 MRS培养基，最适pH 5.5，最适温度30℃。

3 讨论

本文采用多相分类鉴定技术对我国海南西沙诺尼发酵果原浆中的分离菌株CICC 10881进行“种”水平分类地位的鉴定。多相分类的概念最早是由Colwell［12］提出的，综合利用微生物多种不同信息，包括表型、基因型和系统发育分析，对微生物进行分类的方法，已广泛应用于微生物分类学研究领域。

本研究利用细菌通用引物27f和1492r对菌株CICC 10881的16S rRNA基因序列扩增和序列测定，利用MEGA 5进行系统进化分析，CICC 10881被鉴定为醋杆菌属(Acetobacter sp.)。结合形态、培养特征观察、生理生化特征试验以及16S-23S rRNA基因序列分析，最终确定CICC 10881为东方醋杆菌(Acetobacter orientalis)。

东方醋杆菌(Acetobacter orientalis)是2002年Lisdiyanti等［13］从印度尼西亚美人蕉花中首次分离到，此外在印尼的水果杨桃和椰子果、以及传统发酵豆制品天贝中也发现东方醋杆菌的存在。目前，尚未见从诺尼果原浆中分离到东方醋杆菌(Acetobacter orientalis)的报道，国内也没有该菌种的保藏，该菌尚属首次在诺尼果原浆中分离获得，亦是我国首次分离获得此菌种。本课题组不仅在诺尼发酵果原浆中发现该菌作为优势菌存在，更重要的是在诺尼果实中也分离到这种内生细菌。因此，推断该菌是诺尼果实发酵过程中起关键作用的一种微生物。本文也对菌株CICC 10881的培养条件进行了研究，与诺尼果原浆的低pH等环境特征一致，其最适培养条件为MRS培养基，最适温度30℃，最适pH 5.5，这为研究该菌的生物学功能、菌剂的开发以及用于诺尼果发酵工艺的改进等方面奠定基础。

图6 培养基(a)、温度(b)、初始pH值(c)对菌株生物量的影响Fig.6 Effects of medium(a)，temperature(b)and pH(c)on the biomass of the strain

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