磷酸二酯酶-4抑制剂对烟雾诱导的COPD大鼠肺组织中MUC5AC表达的影响及其作用机制的研究＊

西安市中心医院呼吸内科（西安710003） 董 玉 周 宇 李满祥 刘 安 李东繁 黄妙毅

随着吸烟人数的增多及环境严重污染，慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease，COPD）患病率和病死率逐年上升，严重影响人类健康。吸烟是COPD最重要的危险因素，香烟烟雾中的活性氧类物质 （ROS）等，能够通过活化ERK和J n k信号通路，诱发下游相关粘液蛋白的表达，继而促进气管粘液高分泌［1，2］。而气管粘液高分泌是COPD重要病理生理特征之一。近年来很多研究表明：它可以导致并加重呼吸道气流阻塞，加速肺功能下降进程，易导致气管内感染且不易控制，增加该疾病的住院率及病死率，粘液高分泌已成为影响COPD病情和预后的独立危险因素［3］。粘蛋白（Mucin，MUC）5AC是气管主要的分泌型粘蛋白，在人气管上皮的杯状细胞中高度表达，也是病理性增加的主要粘蛋白表型［4］。罗氟司特为磷酸二酯酶-4（PDE4）抑制剂，主要通过抑制PDE，增加cAMP或cGMP含量调控细胞生理功能，可舒张支气管、减轻水肿、抑制免疫及炎症细胞活性，被广泛用于治疗支气管哮喘和COPD［5］。本研究拟对PDE4抑制剂罗氟司特对烟雾诱导大鼠粘液高分泌中Muc5AC表达的抑制作用及相关信号传导通路进行探讨，为临床的靶向性治疗奠定基础。

材料与方法

1 材料与试剂 Wistar大鼠购自西安交通大学医学院动物实验中心。总RNA提取试剂盒（RNAfast200）购自上海飞捷生物技术公司；逆转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司；引物由上海生物工程技术服务有限公司合成；兔抗MUC5 AC抗体购自Abcam；SP试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥。

2 COPD大鼠模型建立及分组

2．1 动物分组：选择12周清洁级健康 Wistar大鼠24只，雌雄各半，体重190～220g，体重降次排序，按随机数字表方法将大鼠分为对照组、烟雾组、药物组、烟雾＋药物组（简称烟＋药组），每组6只。饲养环境：对照组和药物组大鼠置于无烟环境中饲养，烟雾组和烟＋药组大鼠暴露于有烟环境；对照组和烟雾组大鼠以等剂量注射用水灌胃，药物组和烟＋药组大鼠用等剂量罗氟司特灌胃；雌雄分箱同温（18～20℃）、同湿度（40%～60%），自由饮水，普通食料喂养16周。

2．2 大鼠模型建立：①罗氟司特灌胃：药物组和烟＋药组大鼠给予罗氟司特0．5mg／d，每日上午9：00灌胃1次，共16周。其他两组等量注射用水灌胃。②熏烟：将烟雾组和烟＋药组大鼠置于自制有机玻璃染毒箱内，箱顶留有直径为1．5cm的通气孔，箱内放置钠石灰吸收CO2，以无水CaCl2吸收水蒸气。将香烟点燃后接于烟嘴上，用60ml注射器连续吸人烟雾，并通过接有三通的输液管注入箱内，每次16支香烟，箱中烟雾浓度约为7%。抽吸完毕等待30min，2次／d，间隔4h，共16周。其他两组大鼠不熏烟，常氧下相同时间和条件饲养。③标本采集：16周后结束造模，各组大鼠麻醉后行气管插管，夹闭其右主支气管，缓慢注入生理盐水2ml灌注左肺，反复3次，回收率为60%～80%。BALF以1500r／min离心10min。取上清液-70℃保存。取右肺叶，由肺门至肺缘作最大切面。部分肺组织液氮保存待测，其余肺组织浸泡于10%中性甲醛中固定4h，常规制备石蜡切片，待HE染色常规病理学检查及免疫组织化学检测。

3 免疫组化法检测大鼠支气管、肺组织粘蛋白MUC5AC表达水平 采用过氧化物酶标记的链酶卵白素（SP）染色法，石蜡切片常规脱蜡、水化，3%过氧化氢，室温5～10min以灭活内源性酶，蒸馏水洗3次，微波抗原修复，滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min；滴加适当稀释的一抗（1∶50），4℃过夜；滴加相应的生物标记二抗，湿盒内室温孵育30min，滴加链霉卵白素（PBS稀释），室温孵育20min；二氨基联本胺（DAB）和H2O2孵育2min，将DAB底物工作液滴加于切片上，显微镜下控制显色，自来水充分冲洗终止显色反应。苏木素轻度复染，脱水，透明，封片，显微镜观察。

4 RT-PCR法检测各组肺组织粘蛋白MUC5 AC转录水平

4．1 组织总RNA的提取：取标本组织约50mg，用Trizol提取总RNA，严格按说明书操作。取RNA 5μl，用逆转录试剂盒（日本Takara公司）合成cDNA链，再以逆转录反应液1μl作为模板，加入PCRMix 12．5μl，上游引物lμl，下游引物1μl及ddH2O 9．5μl至25μl反应体系，用PCR扩增仪进行扩增。MUC5AC引物序列 上游：5ˊTCAACGGAGACTGCGAGTACAC3′下游：5ˊ-TCTTGATGGCCTTGGAGCA3′；内参 GAPDH 上游：5′GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3′，下 游：5′GAAGATGGTGATGGGATTTC3′，产物220bp。引物由上海生工合成。

4．2 PCR反应条件：变性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃30s，共30个循环，72℃延伸5min终止反应。扩增产物用20g／L琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像系统摄影。应用Chemi Image 5500自动电泳凝胶成像分析仪测定目标产物与β-actin扩增带平均灰度值（A），计算目标产物 mRNA表达指数（I），I＝A产物／Aβ-actin。

5 Western法检测大鼠支气管／肺组织粘蛋白MUC5AC表达水平 提取各组大鼠支气管／肺组织总蛋白。BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳，半干转膜法转至PVDF膜。5%脱脂牛奶室温封闭1h。加一抗稀释液4℃孵育过夜。TBST缓冲液洗膜后加入二抗稀释液室温孵育1h。ECL化学发光，暗室显影。

6 统计学处理 采用SPSS13．0软件包对所有数据进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0．05为有显著性差异，P＜0．01为有极显著性差异。

结 果

1 四组大鼠肺组织病理学变化 光镜下烟雾组大鼠气管管壁充血水肿明显，存在广泛的黏膜上皮脱落、糜烂及溃疡形成，黏膜内杯状细胞增生肥大，可见大量炎症细胞浸润，且呼吸细支气管、终末细支气管及肺泡腔扩大，形成小叶中央性肺气肿，呈COPD改变。单纯罗氟司特干预组的肺组织与对照组相比无明显变化。而烟雾＋罗氟司特组大鼠肺组织以上改变均较烟雾组轻，仅存在少量杯状细胞增生及少量炎症细胞浸润。

2 四组大鼠肺组织MUC5AC免疫组化染色结果 见图1。与正常对照组相比，烟雾组MUC5AC的阳性表达率及表达强度明显增加，单纯罗氟司特处理组MUC5AC的表达水平无明显变化，而烟雾＋罗氟司特组MUC5AC的阳性表达水平虽高于正常对照组，但与烟雾组相比，其表达水平显著降低。

图1 各组大鼠肺组织MUC5AC蛋白免疫组化染色结果A：对照组B：烟雾组C：罗氟司特组D：烟雾 ＋ 罗氟司特组

3 四组大鼠肺组织MUC5AC在mRNA和蛋白水平的表达情况 见表1及图2～3。PCR结果显示：烟雾组中大鼠肺组织中MUC5AC mRNA表达水平明显高于对照组（P＜0．01）；单纯罗氟司特干预组的MUC5AC mRNA的表达水平较对照组低（P＜0．05）；而烟雾＋罗氟司特组的MUC5AC mRNA表达水平虽高于对照组，但与烟雾组相比，其MUC5AC mRNA表达水平明显降低（P＜0．05）；应用 Western-Blot法检测各组小鼠肺组织MUC5AC蛋白表达变化情况与mRNA水平变化一致。

表1 各组中MUC5AC和MUC5AC mRNA的含量（±s，n＝6）

表1 各组中MUC5AC和MUC5AC mRNA的含量（±s，n＝6）

注：＊与对照组相比，P＜0．05；＃ 与烟雾组相比，P＜0．05

1．00±0．01 1．00±0．03烟雾组 3．11±0．04＊ 2．27±0．08＊罗氟司特 0．86±0．02＊ 0．49±0．01＊烟雾＋罗氟司特 1．35±0．02＃ 1．68±0．05 MUC5AC MUC5AC mRNA对照组组 别＃

图2 各组大鼠肺组织MUC5AC mRNA表达水平

图3 各组大鼠肺组织MUC5AC蛋白表达水平

讨 论

近年来 ，关于哮喘的发病机制的研究已取得了重要进展，目前认为哮喘是嗜酸粒细胞、肥大细胞和T淋巴细胞等多种炎症细胞参与的气管慢性炎症性疾病，以可逆性气管阻塞和气管高反应性为特征［6，7］。COPD气流受限与呼吸道炎症密切相关，呼吸道粘液大量分泌是炎症反应的结果，而粘液又是细菌良好培养基，形成恶性循环加重炎症反应和气流阻塞。粘蛋白是粘液的主要组成成分，在肺表达的至少有10种，其中MUC2、MUC5AC、MUC5B为气管主要的分泌性粘蛋白，通常认为MUC5AC是气管中主要粘蛋白基因而且是气道杯状细胞增生的标志［8］。罗氟司特能够抑制肺纤维化、气道重塑、粘液分泌及肺气肿等［9，10］。Diana等在实验中发现罗氟司特显著抑制了COPD患者痰液中中性粒细胞、嗜酸粒细胞的数量，细胞因子IL-8、中性粒细胞弹性蛋白酶及嗜酸粒细胞阳离子蛋白水平亦受到明显抑制；与此同时，评价气道阻塞程度的重要指标FEV1在治疗后获得了明显改善，提示罗氟司特促进了疾病缓解［11］。罗氟司特作为第2代选择性PDE抑制剂的代表，已先后在欧洲、美国批准上市，用于COPD的治疗，其对于中重度COPD患者预防急性加重、改善肺功能及提高生存质量等方面的作用得到肯定，应用前景广阔。罗氟司特作为选择性PDE4抑制剂的优势在于广泛抑制了COPD患者气道中各类炎症细胞的募集、炎症介质、细胞因子、趋化因子及蛋白酶的释放，从而产生有效的抗炎作用［12］。罗氟司特能抑制人气管黏液上皮细胞MUC5AC mRNA的表达和粘蛋白的分泌［7］。而且已证实罗氟司特可抑制成纤维细胞趋化及其介导的胶原收缩，还可抑制TNF-a诱导的成纤维细胞释放前MMP-1、MMP-1及MMP-9增加［13］，以上结果均提示：PDE4抑制剂可能在气管壁重塑中起抑制作用。目前国内外还没有报道罗氟司特抑制MUC5AC mRNA的表达和粘蛋白分泌的动物实验及其发生机制的研究。本研究通过熏烟法建立COPD大鼠模型，使用免疫组化法，PCR及 Western等测定MUC5AC蛋白含量，烟雾组大鼠肺组织MUC5AC的mRNA及蛋白表达水平明显升高，而烟雾＋罗氟司特组MUC5AC的表达水平较烟雾组显著降低。选择性PDE抑制剂罗氟司特能够通过降低MUC5AC的水平，从而为COPD的治疗提供一个新的靶点。

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