具协同催化效应的毕赤酵母全细胞催化生物柴油制备

李锚，贺珧珈，徐莉，张后今，闫云君

(华中科技大学 生命科学与技术学院 分子生物物理教育部重点实验室，湖北 武汉 430074)

随着化石燃料的消耗及环境污染的日益严重，新型清洁可再生能源开发对人类社会可持续发展的重要性日益凸显［1-2］，受到广泛关注［3］。在目前已知的生物柴油制备工艺中，生物酶法生物柴油制备工艺因其反应条件温和、无污染、原料来源丰富、反应产物易分离等优点而被认为具有较好应用前景［4］。来源丰富的微生物脂肪酶作为一种高效的生物催化剂，在生物柴油制备中的应用研究已有很多报道［5-11］。但固定化酶需要的分离、纯化和固定化过程复杂，游离酶又不稳定、易失活，因此价格昂贵，极大地阻碍了生物酶法生产生物柴油的工业化［12］。

表面展示技术的发展，使脂肪酶能够展示于酵母细胞表面，进而解决了生物酶法生物柴油制备工艺中存在的问题。南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B，CALB)是一种应用广泛的脂肪酶，且已有研究证实其与嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase，TLL)在催化生物柴油制备时具有协同效应［11］。但截至目前，尚未见有将这两种具有协同催化效应的脂肪酶共展示于酵母细胞表面并应用于催化生物柴油合成的报道。

本研究将表面共展示有CALB 与TLL 脂肪酶的毕赤酵母工程菌经高密度发酵、冷冻离心及真空冷冻干燥制备得冻干全细胞催化剂，用于生物柴油制备，探索了反应体系、全细胞添加量、反应温度及醇油摩尔比等反应条件，并进一步做了正交优化。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

表面共展示CALB 与TLL 脂肪酶的毕赤酵母GS115，自制;脂肪酸甲酯标准品(C16 ∶0，C17 ∶0，C18 ∶0，C18 ∶1，C18 ∶2，C18 ∶3)，色 谱 纯;PEG20000、甲醇、乙腈、丙酮、叔丁醇、正己烷、正庚烷、异辛烷、石油醚等均为分析纯。

福立GC9790 气相色谱;FID 检测器;安捷伦HP-INNOWAX 19091-133 色谱柱;FD-1D-50 真空冷冻干燥机。

1.2 实验方法

1.2.1 全细胞催化剂的制备 收集发酵液，4 ℃下6 000 r/min 离心5 min，弃上清，磷酸盐缓冲液(pH 8.0，50 mmol/L)清洗2 ～3 次，用PEG20000 浓度为5%的磷酸盐溶液重悬细胞，静置30 min，－80 ℃预冻12 h，真空冷冻干燥24 h，收集干燥后微黄、颗粒粉状物质，即为冻干的全细胞。

1.2.2 转酯化反应 在50 mL 带塞玻璃锥形瓶中，加入大豆油2.19 g 与一定量的甲醇和有机溶剂，再加入一定量的全细胞催化剂，40 ℃，200 r/min，反应结束后，12 000 r/min 离心10 min，取上清(即得反应产物)，进行气相色谱分析。

1.3 分析方法

1.3.1 酶活力的测定 采用碱式滴定法测定全细胞水解橄榄油乳化液的活力［13］。将经离心收集或干燥后的细胞用Tris-HCl(pH 8.0，0.05 mol/L)制成细胞悬液备用。取橄榄油乳化液4 mL，Tris-HCl(pH 8.0，0.05 mol/L)5 mL，配制反应体系，40 ℃预热5 min，加入细胞悬液1 mL(对照组加入Tris-HCl溶液1 mL)，反应10 min，加入15 mL 终止液。用0.05 mol/L NaOH 溶液滴定，记录消耗的NaOH 溶液的体积。

酶活力单位(U)定义:40 ℃，pH 8.0 时，单位时间(即每分钟)催化水解橄榄油产生1 μmol 游离脂肪酸所需的脂肪酶量定义为一个活力单位(U)。测得表面共展示CALB 与TLL 脂肪酶的毕赤酵母GS115 酶活力为1 700 U/(g-dry-cell)。

1.3.2 GC 检测 去酶催化反应后离心得的生物柴油10 μL 溶于300 μL 十七碳内标(1 mg/mL)，再加入正己烷290 μL，涡旋震荡混匀。用微量进样针吸取样品1 μL，待气相色谱运行稳定，且处于准备状态时注入进样口，启动设定的样品检测程序进行检测。色谱仪配置:INNOWAX 毛细管柱(30 m ×0.25 mm×0.25 μm);氢火焰离子检测器(FID);N2000 气相色谱工作站。载气氮气，柱前压0.1 MPa，气化室温度230 ℃，检测器温度280 ℃。柱温采用一阶程序升温:初始柱温180 ℃，以3 ℃/min 的速率升到230 ℃，再 在 该 温 度 维 持1 min。内标法计算生物柴油得率。

式中 Y——大豆油甲酯化得率，%;

m——脂肪酶催化大豆油各脂肪酸甲酯量，g;

M——大豆油完全甲酯化后脂肪酸甲酯量，g。

2 结果与讨论

2.1 有机溶剂的选择

有机溶剂体系自上世纪80 年代被美国科学家Klibanov［14］首次报道并证实了脂肪酶在该体系催化反应的可行性后，脂肪酶有机溶剂体系催化反应成为研究热点。全细胞催化的反应体系中必须要有合适的反应溶剂才能取得较好的催化效果。图1 列出了所选择的不同有机溶剂介质体系中全细胞催化剂的相对催化活力(以叔丁醇为参照)［15］。反应条件:细胞量0. 1 g，甲醇∶豆油(n/n)= 4 ∶1，40 ℃，200 r/min，72 h，溶剂50%。

图1 反应溶剂的影响Fig.1 Effects of solvents on biodiesel production

由图1 可知，以叔丁醇为反应介质时，表面共展示CALB 与TLL 脂肪酶毕赤酵母全细胞催化剂表现出较高的催化活力，相比而言，其他有机溶剂及无溶剂的反应体系中全细胞催化活力均很低。因此，选定叔丁醇为反应溶剂。

2.2 叔丁醇添加量对全细胞催化反应的影响

反应体系中叔丁醇加入量对表面共展示CALB与TLL 脂肪酶毕赤酵母全细胞催化油脂甲醇解反应的影响见图2。反应条件:细胞量0.5 g，甲醇∶豆油(n/n)=4 ∶1，40 ℃，200 r/min，72 h。

图2 叔丁醇加入量的影响Fig.2 Effects of t-butanol amount on biodiesel production

由图2 可知，当叔丁醇加入量小于底物油重20%时，油脂甲酯得率随着叔丁醇加入量的增加呈明显上升趋势;当叔丁醇加入量超过底物油重20%时，油脂甲酯得率则缓慢降低。当叔丁醇添加量为底物油重20%，反应72 h，甲酯得率可达71.4%。

作为反应溶剂，叔丁醇添加量对表面共展示CALB 与TLL 脂肪酶毕赤酵母全细胞催化生物柴油制备具有十分重要的意义。叔丁醇添加量过少，甲醇与油脂溶解不均匀，且高浓度甲醇对酶毒害作用较大;叔丁醇添加量过多则会使得反应物浓度过小，降低了分子有效碰撞几率从而使得反应速率降低。综上，适宜的叔丁醇添加量对反应高效进行具有重要意义。实验结果表明，最佳叔丁醇添加量为底物油重20%。

2.3 醇油摩尔比的影响

反应条件:细胞量0. 5 g，40 ℃，200 r/min，72 h，溶剂量20%，甲醇加入量对反应的影响见图3。

图3 醇油摩尔比的影响Fig.3 Effects of methanol/oil ratio on biodiesel production

由图3 可知，在20%叔丁醇添加体系中，甲醇解甲酯得率随着醇油比的增加而增加，在醇油摩尔比4 ∶1，甲酯得率最大，随后呈缓慢下降趋势，因此，选取醇油摩尔比4 ∶1 进行反应。

2.4 全细胞添加量的影响

反应条件:甲醇∶豆油(n/n)= 4 ∶1，40 ℃，200 r/min，72 h，溶剂量20%，全细胞添加量的影响见图4。

图4 全细胞添加量的影响Fig.4 Effects of whole-cell biocatalyst amount on biodiesel production

由图4 可知，反应速率随着全细胞添加量的增加而加快。全细胞添加量为0.6 g，反应72 h，甲酯得率可达79.32%。继续增加全细胞添加量，甲酯得率不再增加，呈微弱下降趋势，有研究指出这一现象可能与体系中传质阻力的增加有关［15］。从经济角度考虑，确定全细胞添加量为0.6 g。

2.5 水添加量的影响

脂肪酶催化的反应多发生在油水界面，水添加量的影响见图5。反应条件:细胞量0.6 g，甲醇∶豆油(n/n)= 4 ∶1，40 ℃，200 r/min，72 h，溶剂量20%。

图5 水添加量的影响Fig.5 Effects of water content on biodiesel production

由图5 可知，在水添加量低于4%时，呈微弱激活效应，当添加量大于5%时，甲酯得率降低显著。这可能是过量水的存在，使得水解副反应的发生所致。

2.6 反应温度的影响

反应条件:细胞量0.6 g，甲醇∶豆油(n/n)=4∶1，35 ℃，200 r/min，72 h，溶剂20%，水3%，反应温度的影响见图6。

图6 温度的影响Fig.6 Effects of temperature on biodiesel production

由图6 可知，叔丁醇介质体系中表面共展示CALB 与TLL 脂肪酶的毕赤酵母全细胞作为催化剂适于低温催化反应，当温度超过45 ℃时，对酶的毒害作用显著。综合考率经济、节能原则，选取35 ℃作为最佳实验温度。

2.7 反应时间的影响

酶促反应是一个动态可逆过程，反应进行到一定程度，正逆反应速率达到平衡，产物不再增加。反应条件:细胞量0.6 g，甲醇∶豆油(摩尔比)=4 ∶1，40 ℃，200 r/min，溶剂20%，水3%，实验考察了反应时间的影响，结果见图7。

图7 反应时间的影响Fig.7 Effect of reaction time on biodiesel production

由图7 可知，甲酯得率随着反应时间的延长而增加，24 h 前，速率增长显著，随后增速十分缓慢。选取24 h 为收获时间。此时，甲酯得率80.99%。

2.8 正交优化

用正交实验设计对影响全细胞催化油脂甲酯得率的酶用量、醇油摩尔比、反应温度、反应时间等因素作近一步优化。实验设计及结果分别见表1 与表2，方差分析见表3。

由表3 可知，较为显著的影响因素是时间和全细胞添加量。由表2 可知，最优反应条件组合为:A3B2C2D3，即全细胞添加量0.7 g，醇油摩尔比4 ∶1，温度35 ℃，时间36 h。验证实验表明最优条件下甲酯得率，达86.23%。

表1 正交实验设计Table 1 Orthogonal experimental design

表2 正交实验结果Table 2 Orthogonal experimental results

表3 正交实验结果方差分析Table 3 Variance analysis of the orthogonal experiment results

3 结论

表面共展示具协同催化效应CALB 与TLL 脂肪酶的毕赤酵母全细胞的催化剂可催化叔丁醇介质体系下油脂甲醇解生物柴油制备，优化反应条件为:全细胞添加量0.7 g，醇油摩尔比4 ∶1，温度35 ℃，时间36 h。在此条件下，甲酯得率可达86.23%。

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